Определение субпопуляций Т-лимфоцитов при ВИЧ

778

Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекция.

Методические рекомендации1

Содержание

1. Область применения.

2. Введение.

3. Принцип метода проточной цитофлуориметрии.

4. Безопасность работы в лаборатории.

5. Персонал, выполняющий исследования проточной цитофлуориметрии.

6. Лабораторное оборудование.

6.1. Приборы.

6.2. Реактивы, контрольные и расходные материалы.

6.2.1. Расходные материалы.

6.2.2. Реактивы для окрашивания лимфоцитов.

6.2.3. Стандарты настройки, калибровки и контрольные материалы.

6.2.4. Реагенты для работы проточного цитофлуориметра и гематологического анализатора.

7. Порядок выполнения исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов.

7.1. Преаналитический этап.

7.1.1. Подготовка пациента.

7.1.2. Факторы, влияющие на количество клеток периферической крови.

7.1.3. Влияние диагностических и лечебных процедур.

7.1.4. Взятие пробы из катетеров.

7.1.5. Системы для взятия венозной крови у пациентов.

7.1.6. Выбор антикоагулянтов.

7.1.7. Процедура забора крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов.

7.1.8. Хранение и транспортировка образцов крови.

7.1.9. Получение и прием образцов в лаборатории.

7.1.10. Пригодность образцов крови.

7.2. Приготовление аналитических проб для исследования на проточном цитофлуориметре.

7.2.1. Моноклональные антитела.

7.2.2. Выбор панели моноклональных анител для мониторинга ВИЧ-инфекции.

7.2.3. Подготовка образца периферической крови для исследования на проточном цитофлуориметре.

7.2.4. Методика выявления погрешности дозирования.

7.2.5. Метод проверки точности дозирования.

7.3. Калибровка проточных цитофлуориметров и создание протокола анализа.

7.3.1. Калибровка проточных цитофлуориметров.

7.3.2. Настройка проточного цитофлуориметра.

7.3.3. Стратегии гейтинга для подсчета CD4 T-лимфоцитов.

7.3.4. Исследование образца на проточном цитометре.

8. Контроль качества исследования субпопуляционного состава клеток периферической крови на проточный цитофлуориметрах.

8.1. Определение границ нормы клеточных популяций периферической крови для каждого региона, для каждой лаборатории.

8.2. Внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований.

8.2.1 Состояние прибора.

8.2.2. Подготовка образца.

8.2.3. Стабилизированные контрольные материалы.

8.2.4. Аналитический контроль.

8.3. Внешний контроль качества проводимых исследований.

9. Постаналитические процедуры.

10. Ведение документации.

11. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови при мониторинге ВИЧ-инфекции с использованием приборов, специально разработанных для ВИЧ-инфицированных пациентов.

11.1. Определение содержания субпопуляций лимфоцитов на проточном цитофлуориметре BD FACSCount.

11.2. PimaTM — анализатор для подсчета CD4-лимфоцитов в цельной крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов.

12. Словарь терминов.

13. Литература.

1. Область применения

В настоящих методических рекомендациях рассмотрены вопросы организации лабораторий, выполняющих исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов, необходимого при мониторинге ВИЧ-инфекции. Описан весь порядок процедуры лабораторного исследования, который подразделяется на этапы: преаналитический, аналитический и постаналитический. Приведены причины ошибок, которые способны повлиять на результаты тестов при фенотипировании лимфоцитов периферической крови, а также порядок проведения внутрилабораторного и необходимость участия во внешнем контроле качества проводимых лабораторных исследований. Подробно описана и проанализирована вся цепь событий, от назначения пациенту исследования клеточных популяций лимфоцитов периферической крови до получения результата и его интерпретации.

Настоящие рекомендации предназначены как для врачей клинической лабораторной диагностики, так и для клиницистов, процедурных сестер, специалистов, выполняющих исследования методом проточной цитофлуориметрии и необходимы для максимально корректного проведения исследования, на котором основано ведение и мониторинг ВИЧ-инфицированного пациента.

2. Введение

Прошло больше четверти века с момента регистрации первого ВИЧ-инфицированного пациента в России. Однако и в настоящее время определение количества CD4 Т-лимфоцитов остается одним из главных критериев оценки прогрессии заболевания у  ВИЧ-инфицированных пациентов, служит критерием для назначения антиретровирусной терапии (АРВТ) и мониторинга ее эффективности.

Необходимо учитывать, что с каждым годом количество ВИЧ-инфицированных граждан в России продолжает расти и увеличивается число пациентов нуждающихся в терапии, что в свою очередь, приводит к увеличению необходимых исследований. Открываются новые лаборатории, появились лаборатории в Федеральной системе исполнения наказания (ФСИН). Кроме того, за четверть века практически во всех лабораториях произошла частичная или полная смена кадров, постоянно меняется материальное обеспечение, меняется парк приборов. Поэтому остается актуальным вопрос о качестве проводимых исследований и необходимости обучения персонала, а также критерии обеспечения лабораторий приборами и реагентами.

Определение количества CD4 Т-клеток осуществляется методом проточной цитометрии, который, в настоящее время, прочно вошел в практику лабораторий центров по профилактике и борьбе со СПИД (ПБ СПИД).

В настоящее время разработаны алгоритмы оптимизации работы на проточных цитофлуориметрах. Работают ежегодные школы по проточной цитометрии ( Санкт-Петербург, Челябинск). В лаборатории Федерального Центра ПБ СПИД проводятся тренинги по программе GLP (добросовестной лабораторной практике оценки СD4 Т-лимфоцитов). При необходимости можно получить консультации по телефону, приехать на «рабочее место» для обучения на различных приборах.

В марте 2014 профильной комиссией Минздрава России по клинической лабораторной диагностике одобрена стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлуориметров-анализаторов». Организована общероссийская программа контроля качества лабораторных исследований по разделу «проточная цитометрия». Программы внешнего контроля качества являются необходимым условием для всесторонней гарантии качества, и без них сложно поддерживать единообразие лабораторных исследований, необходимое для адекватного мониторинга пациентов с  ВИЧ-инфекцией.

Однако процент ошибок остается достаточно высоким, а это может приводить к неправильной интерпретации полученных результатов и как следствие — неадекватному ведению пациента. Это связано с частой сменой кадров, недостаточно согласованной работой клинического и лабораторного подразделений. Все результаты лабораторного исследования должны быть сопоставлены с клинической картиной заболевания пациента на момент обследования.

Цель настоящих рекомендаций — стандартизировать процедуру определения субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов при мониторинге ВИЧ-инфекции.

3. Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитофлуориметрия — технология, позволяющая измерять физические и/или химические характеристики клеток или других биологических и небиологических частиц, находящихся в потоке жидкости.

Метод проточной цитофлуориметрии позволяет получить информацию об относительном размере клеток, их типе и функциональном состоянии. Применение конъюгатов различных флуорохромов с моноклональными антителами, специфичными к определенным антигенам клетки позволяет оценить наличие на клетке тех или иных рецепторов. После чего идентифицировать популяции клеток по набору характерных для них, строго определенных поверхностных антигенов и их функционального состояния. Современные проточные цитофлуориметры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 105 клеток в секунду, что гарантирует статистическую достоверность результатов. Использование логических ограничений позволяет выделять отдельные субпопуляции клеток, что очень важно при характеристике гетерогенных клеточных популяций таких, как периферическая кровь. Возможность регистрировать интенсивность флуоресценции отдельных объектов сделала этот метод высоко информативным и широко применяемым.

Проточный цитофлуориметр включает в себя три системы: систему потока жидкости, оптическую и электронную.

Основной принцип проточной цитометрии заключается в следующем (рис. 1): через проточную ячейку (1) под определенным давлением движется постоянный ток изотонического раствора, который называется «обжимающим» (2). Внутри проточной ячейки находится зонд, из которого в центр быстро движущегося потока жидкости подается образец (3), содержащий клетки. Условия подобраны таким образом, что за счет разницы давлений в зонде и «обжимающей» жидкости происходит гидродинамическое фокусирование струи в струе. Клетки в потоке выстраиваются друг за другом и пересекают луч источника света. Проходя через луч лазера, клетки рассеивают свет.

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов при ВИЧРис. 1.Система потока жидкости. Гидродинамическое фокусирование

Рассеяние света в направлении лазерного пучка под малыми углами 1–100 (прямое светорассеяние — FSC, forvard scatter) позволяет определять относительные размеры клеток. Рассеяние света под углом 900 по отношению к лазерному лучу (боковое светорассеяние — SSC, side scatter) позволяет определить относительную гранулярность клетки. Таким образом, используя эти два параметра светорассеяния, можно идентифицировать три популяции лейкоцитов: лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Для фокусировки луча и придания ему формы используется система линз. Они собирают свет, образующийся в результате взаимодействия лазера и клетки. Система оптических зеркал и фильтров, направляет свет к соответствующим детекторам, которые распознают световой сигнал. Используются фотодетекторы двух типов: фотодиоды — для прямого светорассеяния и фотоэлектронные фотоумножители (ФЭУ) — для бокового светорассеяния и измерения интенсивности флуоресценции. Современные проточные цитометры, как правило, оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями (от 3 до 9 ФЭУ), что позволяет на одном образце периферической крови проанализировать практически все основные субпопуляции клеток. После распознавания световой сигнал преобразуется в электрический импульс, величина которого пропорциональна интенсивности светового сигнала. Усиленные и преобразованные сигналы подвергаются цифровому преобразованию и поступают в компьютер для анализа, запоминания и отображения.

4. Безопасность работы в лаборатории

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится ко II группе патогенности, однако все манипуляции, связанные с иммунологическими (серологическими) исследованиями, производятся согласно санитарным правилам «Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности и гельминтами».

Всем сотрудникам необходимо пользоваться общими правилами безопасности при работе в лаборатории согласно ГОСТ Р 52905–2007.

Все правила безопасности обращения с биологическими материалами должны существовать в виде инструкций и быть легко доступны. Весь персонал лаборатории, задействованный в исполнении всех этапов, обеспечивающих проведение проточной цитофлуориметрии, должен быть хорошо подготовлен, чтобы выполнять и обеспечивать выполнение инструкций по технике безопасности.

Биологическая безопасность

Весь персонал должен быть проинструктирован согласно установленным правилам о необходимости использования личных средств защиты (халаты, перчатки, защитные очки) во время регистрации биологического материала, подготовки образцов, работы на проточном цитофлуориметре и утилизации отходов.

Для дозирования крови и реагентов используйте одноканальные дозаторы и одноразовые наконечники. При заборе крови необходимо использовать одноразовые шприцы и иглы. Иглы не переодевать! Проводить центрифугирование в безопасных держателях. Шприцы, иглы и пробирки с биологическими жидкостями выбрасывают в специальные контейнеры, с маркировкой для дальнейшей утилизации. Отходы в резервуаре проточного цитофлуориметра дезинфицируются добавлением деконтаминирующего раствора в объеме 10% от объема резервуара. Проточный цитофлуориметр после работы дезинфицируется, как рекомендовано в инструкции. Для всего персонала необходимо обязательное мытье рук и их обработка дезсредствами после работы.

Ликвидация биологических опасных отходов проводится в соответствии с СанПиН 2.1.77 2790–10 и разработанными в каждой лаборатории СОПами. В лаборатории должна быть разработана инструкция о порядке действий при аварийных ситуациях. При возникновении случаев ранения, или попадания зараженного материала на кожу, слизистые необходимо сообщать о происшествии в соответствии с установленными правилами. В лаборатории должен осуществляться контроль за выполнением рабочих инструкций, чтобы исключить контакт с источником заражения в крови во время флеботомии и лабораторной диагностики.

Для выполнения метода проточной цитофлуориметрии необходимо несколько помещений: помещение для приема проб и их регистрации, помещение подготовки проб для анализа, помещение, в котором размещен проточный цитофлуориметр, необходимый для проведения исследования.

Прием проб и все манипуляции с образцами (открывание пробирок, дозирование крови, реактивов, смешивание и т. д.) следует выполнять в ламинарном шкафу, соответствующем III–IV классу биологической безопасности (класс I–II по международной классификации). Если образец был разлит, продезинфицируйте поверхность раствором в соответствии с СанПиН.

Все этапы иммунологического исследования, от приема образцов до выдачи результатов должны осуществляться строго при комнатной температуре, т. е.18-230С.

По окончанию работы проводится текущая дезинфекция рабочих мест, помещений лаборатории с использованием средств, рекомендуемых согласно СанПиН. Проводится утилизация использованных расходных материалов, согласно установленным стандартным операционным процедурам (СОП — должны быть разработаны в каждой лаборатории, проводящей исследование образцов ВИЧ-инфицированных пациентов). После работы с образцами снимите перчатки и вымойте руки водой с мылом. Не используйте резиновые перчатки дважды.

Все сотрудники регулярно должны проходить инструктаж по правилам техники безопасности.

5. Персонал, работающий в лаборатории проточной цитофлуориметрии

Специалисты с высшим образованием: врачи клинической лабораторной диагностики, биологи — проводят исследования на проточном цитофлуориметре и по результатам дают заключение об отклонениях от референсных значений.

Врачи и биологи должны пройти специализацию и повышение квалификации в установленном законом порядке, иметь сертификат об обучении от  фирмы-производителя прибора, врачи должны иметь сертификат по специальности «Клиническая и лабораторная диагностика».

Сотрудники со средним специальным образованием: фельдшер-лаборант, лабораторный техник, лабораторный технолог, лаборант — осуществляют: прием и регистрацию полученного биологического материала, проводят подготовку проб для исследования на проточном цитофлуориметре и регистрацию результатов.

6. Лабораторное оборудование

6.1. Приборы

Гематологический анализатор.Вихревой встряхиватель (вортекс).Набор одноканальных дозаторов (механических или электронных) со сбрасывателем наконечников. Рекомендуется использовать дозаторы с постоянным объемом.Холодильник фармацевтический для хранения моноклональных антител.Холодильник бытовой (t 2 -80 °C).Настольная лабораторная центрифуга до 3000 об/мин.

Для региональных, областных центров СПИД и лабораторий с количеством проводимых исследований более 50 ежедневно.

Проточный цитофлуориметр, с возможностью проведения многоцветного анализа (минимум от трех цветов). Прибор должен быть соединен с компьютером (рабочей станцией) и принтером.Для лабораторий с количеством исследования менее 50 ежедневно, приборы, разработанные специально для ВИЧ-инфицированных пациентов.Рабочие станции для проведения лизиса эритроцитов, для лабораторий с количеством проводимых исследований более 50 в день, ежедневно (желательно).

Все приборы и реагенты должны иметь регистрационные удостоверения и пройти регистрацию в установленном порядке.

6.2. Реактивы, контрольные и расходные материалы

6.2.1. Расходные материалы.

Одноразовые пластиковые пробирки для окрашивания проб и цитофлуориметрических исследований, размером 75×12 мм. (Не использовать дважды!)Пластиковые штативы для пробирок.Одноразовые наконечники. (Не использовать дважды!)Контейнеры для утилизации отходов.Дезрастворы, применяемые в соответствии с СанПиНами и СОПами, разработанными внутри лаборатории.Резиновые перчатки. (Не использовать дважды!)

6.2.2. Реактивы для окрашивания лимфоцитов.

При использовании расходных материалов должны учитываться спецификации производителя.

Моноклональные антитела для клинической диагностики с маркировкой IVD (In Vitro Diagnostic).Изотипический контроль.Реагенты для лизиса эритроцитов с маркировкой IVD.Реагенты для фиксации готовых проб.Для подсчета абсолютного количества CD4 Т-лимфоцитов (любых клеточных популяций лимфоцитов) используются частицы, такие как FlowCount, или пробирки TruCount, содержащие референсные частицы для абсолютного счета.

6.2.3. Стандарты настройки, калибровки и контрольные материалы.

Стандарты настройки — частицы с высокой однородностью и высокой интенсивностью флуоресценции, используемые для верификации оптической настройки и оптимизации системы потока жидкости.Стандарты калибровки содержат набор частиц с разной интенсивностью флуоресценции, окрашенные разными флуорохромами. Используются для оценки параметров состояния системы: линейности, чувствительности, а также оценки динамического диапазона.Контрольно-калибровочные частицы, предназначенные для калибровки проточного цитофлуориметра и ежедневного контроля оптической настройки и системы потока жидкости.Стабилизированная кровь с известным количеством клеточных популяций и субпопуляций лимфоцитов (например: ImmunoTroll).

6.2.4. Реагенты для работы проточного цитофлуориметра и гематологического анализатора, в соответствии с фирмой производителем вашего прибора.

«Обжимающая» (обтекающая) жидкость для создания гидродинамического фокусирования.Реагенты для промывания и обеззараживания прибора, а также для выключения прибора (если это предусмотрено разработчиками прибора).Реагенты для гематологического анализатора и контрольные материалы в соответствии с инструкцией фирмы производителя прибора.

7. Порядок выполнения исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов

Процедура лабораторного исследования подразделяется на несколько этапов: преаналитический, аналитический и постаналитический. Внелабораторная часть преаналитического этапа начинается с направления конкретного пациента на лабораторное исследование. Далее следует регистрация в процедурном кабинете, забор материала на исследование, транспортировка взятых образцов в лабораторию.

Лабораторная часть начинается с регистрации полученных проб (при необходимости хранение образцов), и включает подготовка проб для исследования на проточном цитофлуориметре. На этом заканчивается преаналитический этап.

Далее образцы анализируются врачом КЛД на проточном цитофлуориметре. Анализ полученных результатов — аналитический этап.

Постаналитический этап — регистрация полученного результата, внесение в базу данных и передача врачу, направившему пациента на обследование или в учреждение, из которого была доставлена проба.

7.1. Особенности преаналитического этапа иммунофенотипирования клеток периферической крови

7.1.1. Подготовка пациента.

Очень важно, чтобы врач, направляющий пациента на исследование клеточных популяций периферической крови, подготовил его к процедуре забора крови и объяснил, как себя вести перед взятием пробы. Необходимо предупредить пациента о времени, когда надо явиться для сдачи крови, сообщить, что в день накануне взятия крови пациенту лучше воздержаться от употребления алкоголя, большого количества пищи (в особенности жирной), а также от чрезмерной физической нагрузки.

7.1.2. Факторы, влияющие на количество клеток периферической крови.

Направляющий на исследование иммунного статуса врач должен знать, что на абсолютное количество клеток периферической крови влияет ряд факторов. Поэтому, как врачам клинической лабораторной диагностики, так и врачам клиницистам необходимо учитывать факторы, влияющие на качество проводимых исследований.

Они подразделяются на немодифицируемые и модифицируемые. К первым относятся: возраст, климат, циркадные ритмы. Ко вторым: прием пищи и лекарственных препаратов, физические нагрузки, стресс, голодание, курение, высота над уровнем моря.

7.1.3. Влияние диагностических и лечебных процедур.

На результаты лабораторных исследований могут оказывать влияние: внутривенное введение лекарственных препаратов, переливание крови, оперативные вмешательства, диализ, пункции, прием лекарственных веществ, эндоскопия, функциональные тесты, ионизирующее излучение. Загрязнение лабораторных проб инфузионными растворами является самой обычной и часто встречаемой формой преаналитической интерференции в лечебных учреждениях.

Пробы следует брать из руки, в вены которой не проводилось вливание. Показано, что кровь, взятая проксимальнее места внутривенной инфузии, может разбавляться вводимым раствором. Перед взятием пробы, после проведенной инфузионной терапии, следует выждать определенный период времени (табл. 1).

Таблица 1

Сроки взятия пробы крови после прекращения внутривенного вливания

Вид вливания Время до взятия пробы
Аминокислоты и гидролизаты белков 1 ч
Электролиты 1 ч
Растворы, богатые углеводами 1 ч
Эмульсии жиров 8 ч

7.1.4. Взятие пробы из катетеров.

При взятии пробы из артериальных или венозных катетеров канюлю следует промыть изотоническим солевым раствором (физиологическим раствором) в объеме, соизмеримым с объемом катетера. Первые 5 мл крови следует выбросить и только затем взять основную пробу. В сопроводительном направлении образца в лабораторию, необходимо указывать: какую процедуру получил данный пациент, когда и какое вливание ему произведено.

7.1.5. Системы для взятия венозной крови у пациентов.

Для обеспечения безопасного и комфортного забора крови у пациента, безопасности медицинского персонала, повышения точности результатов анализа и снижения количества повторных заборов крови необходимо использовать одноразовые вакуумные системы. Системы состоят из трех элементов: стерильная двусторонняя игла, держатель пробирки и пластиковая пробирка с круглым дном и предохранительными заглушками.

Ток крови прекращается, как только прекращается действие вакуума. Пробирки имеют разноцветные крышки, в зависимости от внесенного туда антикоагулянта и одновременно являются центрифужными, а также приспособлены для хранения и пересылки материала в другие лаборатории. Системы обеспечивают стандартизированное получение венозной крови в стерильных условиях, визуальный контроль забираемого объема, что в свою очередь предотвращает нарушение пропорции между антикоагулянтом и кровью. Обеспечивается безопасность персонала и хранение образцов в первичных пробирках. Система обеспечивает безопасную и удобную транспортировку образца.

При заборе крови обычным шприцем и сливании ее в пробирку с антикоагулянтом через иглу, может произойти гемолиз, образовываться мелкие сгустки. Данные несоответствия приводят к выбраковке проб и необходимости повторного забора материала для исследования.

7.1.6. Выбор антикоагулянтов.

В качестве антикоагулянта при сборе образцов, предназначенных для подсчета клеток крови и определения их размера, международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) рекомендовал соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ( К2-ЭДТА, К3-ЭДТА). Поскольку для цитофлуориметрического анализа необходимым условием является наличие суспензии клеток, то эти антикоагулянты вполне подходят для скрининга иммунного статуса пациентов. Поскольку при применении К2-ЭДТА клетки разбухают больше, то происходит компенсирование, осмотически вызванное сморщивание клеток. Следует отметить, что лимфоциты более стабильны по отношению к ЭДТА, чем нейтрофилы и моноциты. Это необходимо учитывать при хранении крови и использовании ее для подсчета абсолютного количества лейкоцитов. Объем взятой крови должен соответствовать количеству антикоагулянта, для обеспечения концентрации антикоагулянта в образце. При концентрации ЭДТА 1,5 г/л в образцах крови, взятых не более часа назад, возникают очень незначительные изменения морфологии нейтрофилов. Однако при более высоких концентрациях уже в течение первого часа происходит потеря мостиков между сегментами ядер, потеря цитоплазматических связей и раннее разделение, что влияет на морфологические параметры. При использовании рекомендованных концентраций солей ЭДТА (К2- и  К3-ЭДТА) и проведении анализа в пределах 1–4 часов после взятия крови существенных изменений не происходит. Для ЭДТА оптимальная концентрация составляет 1,5±0,15 мг/мл.

Для иммунофенотипирования клеток крови также возможно использование гепарин в концентрации 20 МЕ/мл крови. В случаях, когда в дальнейшем планируются исследования функциональной активности клеток, именно гепарин, как антикоагулянт, необходимо использовать при заборе образцов крови.

Если исследования проводились в один и тот же день, то ЭДТА и гепарин давали равноценные результаты, но после 24 часов хранения, отмечено снижение жизнеспособности нейтрофилов в пробах с ЭДТА.

7.1.7. Процедура забора крови у  ВИЧ-инфицированных пациентов.

Для уменьшения внутри- и межиндивидуальной вариации результатов лабораторных исследований необходимым условием является стандартизация процедуры взятия крови. Существуют общепринятые правила забора крови для иммунофенотипирования.

Нарушения, допущенные на этом этапе, могут повлиять на результат исследования и его дальнейшую интерпретацию.

Пациент должен иметь направление от врача с указанием индивидуального номера пациента (фамилии, имени, отчества), датой рождения, датой и результатом выполнения иммунного блота, номером истории болезни. В бланке направления должна содержаться информация о том, какие исследования необходимо провести пациенту (первичное или повторное исследование), название направившего учреждения, дата последнего осмотра врача и его разборчивая подпись.

Время проведения венепункции

Взятие проб должно проводиться до диагностических и лечебных процедур. Взятию пробы должна предшествовать фаза отдыха. Пробы следует брать утром натощак (между 7–9 часами утра) и не ранее, чем через 12 часов после последнего приема пищи.

Венепункцию проводят на локтевой вене в положении пациента сидя или лежа. Это связано, во-первых, с возрастанием эффективного фильтрационного давления (например, разница между капиллярным давлением и  коллоидно-осмотическим давлением в плазме). Во-вторых, как следствие, вода движется из внутрисосудистого пространства в интерстициальное, что приводит к понижению объема плазмы примерно на 12% у здоровых лиц. Изменение объема плазмы ведет к заметному изменению абсолютного количества клеток.

Рука пациента должна находиться на твердой поверхности, быть вытянута, чтобы плечо и предплечье образовывали прямую линию. Необходимо пропальпировать вену. Место прокола обработать 700 спиртом.

Для облегчения поиска вены накладывается жгут, который следует снять сразу же после попадания иглы в вену. Длительность наложения жгута не более 1 минуты. При более длительном наложении нарушается эффективное фильтрационное давление, что приводит к повреждению клеток и заметному изменению отдельных показателей крови, в частности, концентрации лейкоцитов.

При проколе вены кулак пациента должен быть разжат.

Кровь собирается в вакуумную пробирку небольшого объема, содержащую антикоагулянт, до риски указанной на пробирке (необходимо помнить, что для некоторых гематологических анализаторов и автоматических пробоподготовщиков требуются определенные размеры пробирок).

Необходимо соблюдать правильное соотношение крови и антикоагулянта. Недостаточное количество крови или переполнение пробирки может привести к искажению результатов иммунофенотипирования.

После проведения венепункции пациенту прикладывается стерильная марлевая салфетка и накладывается давящая повязка.

В тех случаях, когда проводилось вливание, и возникала необходимость взятия крови в тот же день, флеботомию необходимо проводить на другой руке.

Во избежание образования сгустков необходимо хорошо перемешивать кровь с антикоагулянтом сразу же после извлечения ее из держателя. Перемешивание осуществляется путем переворачивания пробирки не менее 8 раз.

Применение миксеров и встряхивание пробирок недопустимо, так как это приводит к гемолизу и получению неверных результатов.

При взятии нескольких проб следует соблюдать определенную очередность (таблица 2).

Таблица 2

Очередность наполнения пробирок при взятии венозной крови

№ п/п Последовательность пробирок Субстрат
1 Без наполнителей Сыворотка
2 С цитратом Плазма, кровь
3 С гепарином Кровь
4 С ЭДТА Кровь/плазма

Все образцы цельной крови должны быть маркированы непосредственно во время взятия крови. Фамилия пациента узнается до взятия крови. На пробирке с образцом указываются идентифицирующие данные пациента (фамилия, регистрационный номер), точная дата и время забора крови. В сопроводительных документах должны быть указаны фамилия, имя и отчество пациента, дата рождения, пол, дата и время забора крови, отмечены необходимые исследования.

В случае если в момент обследования пациент принимает лекарственные препараты (антибиотики, гормоны, цитостатики), в сопроводительном документе должны быть сделаны соответствующие пометки.


 1 Проект. МР разработаны СНИО ЭП СПИД ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора (Л.В.Серебровская, О.Н.Хохлова, Л.А.Иванова, Н.В.Герасимова). Утверждены Ученым Советом ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора 18 ноября 2014 года. >> вернуться в статью



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль