Возможности ПЦР при урогенитальных заболеваниях

82

Открытие в конце 1980-х гг. и внедрение в практику научных исследований метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) открыло новые пути для развития современной биологии и медицины. Несколькими годами позже была предложена модификация этого метода, получившая название «ПЦР в режиме реального времени» (ПЦР-РВ). Основное отличие ПЦР-РВ от «классической» ПЦР заключается в том, что регистрация количества ДНК происходит в ходе реакции, а положительный результат определяется по увеличению флуоресцентного сигнала, который регистрируется прибором. В «классической» ПЦР результат оценивают по окончании реакции (рис. 1).

Возможности ПЦР при урогенитальных заболеванияхРис. 1. Кривые накопления продуктов амплификации при полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Автоматическое измерение увеличения флуоресценции, пропорциональное увеличению количества амплифицированной ДНК в ходе реакции ПЦР-РВ, позволяет проводить количественную оценку ДНК (например, микроорганизма), исходно содержавшейся в биологическом образце, в то время как «классическая» ПЦР – это качественная реакция.

В настоящее время метод ПЦР-РВ широко используется для решения целого ряда как фундаментальных научных проблем, так и прикладных диагностических задач, включая количественную диагностику ДНК/РНК микроорганизмов (вирусы гепатитов, ВИЧ), нормо- и условно-патогенной биоты урогенитального тракта у женщин, полиморфных вариантов различных генов (SNP-однонуклеотидные полиморфизмы, HLA-гены главного комплекса тканевой совместимости человека), функциональной активности генов (определение мРНК) и т. д. С помощью метода ПЦР можно из одного образца биоматериала выполнить комплексное исследование ряда параметров, включая количественную оценку микроорганизмов.

Аномальные влагалищные выделения и вульвовагинальный дискомфорт – частые мотивы обращения женщин за врачебной помощью [1, 2]. Причины, которые могут вызывать указанные симптомы, бывают разными [5, 7], в т. ч. могут иметь место инфекционные заболевания. Часть из них связана с ИППП (трихомониаз, хламидиоз, гонорея, микоплазмоз). В других случаях причиной инфекционного процесса могут быть условно-патогенные микроорганизмы (УПМ), причем в последние годы наблюдается увеличение этиологической роли УПМ по сравнению с ИППП.

Клинически инфекционный процесс, вызванный УПМ, может протекать в виде вагинита или вагиноза. Считается, что наиболее часто причиной вагинита, вызванного УПМ, являются аэробные бактерии – кишечная палочка, стрептококки, стафилококки и др. Диагноз вагинита может быть поставлен на основании осмотра в зеркалах и микроскопии окрашенного мазка: при наличии более 10 лейкоцитов в поле зрения, большого количества клеток слущенного эпителия влагалища и отсутствии «ключевых» клеток. В целом наблюдается микроскопическая картина, характерная для воспалительного экссудата.

Диагноз бактериального вагиноза (БВ) выставляется после исключения диагноза бактериального вагинита, на основании критериев, предложенных Amsel R. и соавт [6]:

наличие патологических выделений из половых путей;

рH > 4,5;

положительный аминный тест с KOH (появление специфического «рыбного» запаха при добавлении к вагинальному секрету 10% раствора КОН);

выявление более 20% «ключевых» клеток (клетки плоского эпителия, покрытые коккобактериями) при микроскопии влажных неокрашенных препаратов вагинального отделяемого и мазков, окрашенных по Граму.

Наличие трех признаков из четырех позволяет поставить диагноз БВ. Таким образом, в настоящее время БВ рассматривается как инфекционный невоспалительный синдром полимикробной этиологии, обусловленный дисбиозом вагинального биотопа, который характеризуется уменьшением количества или полным исчезновением лактобактерий и увеличением облигатно-анаэробных УПМ (шифр по МКБ-10 N89.9 – Невоспалительная болезнь влагалища неуточненная) [4].

Объективным симптомом воспаления в случае урогенитальных инфекций является лейкоцитарная реакция. Поскольку БВ считается невоспалительным синдромом, количество лейкоцитов в мазке при БВ должно быть менее 10 в поле зрения [3], хотя этот показатель и не входит в число критериев Амсела.

Развитие инфекционного заболевания, вызванного воздействием патогенных микроорганизмов, а также его исход в равной мере зависят как от патогенного потенциала микроорганизма, так и от защитного потенциала организма «хозяина». В случае УПМ развитие инфекционного процесса в большей мере зависит от организма «хозяина», в т. ч. и от индивидуальных особенностей его иммунной системы.

Не нужно забывать, что воспаление, если оно адекватно действующему на организм стимулу, – это защитная реакция (местная и общая), возникающая в ответ на повреждение клеточных структур организма инфекционным агентом и проявляющаяся в реакциях, направленных на ликвидацию возбудителя инфекции, устранение продуктов повреждения тканей и обеспечивающих восстановление в зоне повреждения.

Первую линию защиты от инфекции обеспечивают различные факторы, прежде всего присутствующие в тканях, контактирующих с внешней средой, – анатомические барьеры, рН, нормальная микрофлора, обеспечивающая колонизационную резистентность, активные формы кислорода, слущивание и регенерация эпителия, антиадгезивные факторы (муцин), секреторный IgA.

Вторая линия защиты – местное, локальное воспаление, которое возникает в случаях, когда факторы врожденной, естественной защиты не справляются с функцией сохранения микробного баланса на поверхности тканей, контактирующих с внешней средой. В результате активируются системы иммунной защиты – система комплемента, рецепторы к различным структурам бактерий и вирусов (toll-like receptor, TLR) на поверхности клеток, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, тучные клетки, которые вырабатывают различные хемокины и цитокины, обеспечивающие привлечение клеток иммунной системы в очаг воспаления, активацию местного иммунитета и развитие адаптивного иммунного ответа.

И наконец, третья линия защиты – общее, системное воспаление, которое развивается в ответ на проникновение микроорганизмов во внутреннюю среду организма, адаптивный иммунитет.

Можно полагать, что местное воспаление и местная иммунная реакция – это наиболее вероятная реакция организма в ответ на размножение УПМ в урогенитальном тракте у женщин.

Для одновременного исследования биоты урогенитального тракта и экспрессии ряда генов иммунной системы были обследованы женщины репродуктивного возраста (от 18 до 45 лет).

По результатам обследования были выделены следующие группы:

I. Условно-здоровые (n = 141): отсутствие жалоб и признаков воспаления, количество лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения;

IA. Контрольная группа (n = 95) – преобладание Lactobacillus spp (80–100% от общей бактериальной массы по результатам ПЦР-РВ);

IB. Наличие ДНК Ureaplasma spp >104 ГЭ/мл (n = 19);

IС. Наличие ДНК Candida spp > 103 ГЭ/мл (n = 27);

II. Вагинит (n = 215): жалобы, воспаленная слизистая, количество лейкоцитов в мазке более 10 в поле зрения;

III. Бактериальный вагиноз (n = 55): жалобы, наличие критериев Амсела, отсутствие воспаления, количество лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения.

Обследование включало анализ жалоб, анамнеза, определение гинекологического статуса, осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование, микроскопия влагалищных мазков, окрашенных по Граму.

Количественная оценка ДНК микроорганизмов проводилась методом ПЦР-РВ с использованием наборов реагентов «Фемофлор-16» (ЗАО «ДНК-Технология»).

Для оценки уровня экспрессии генов, активирующихся при воспалении, определяли транскрипционный профиль генов иммунной системы: цитокины (IL1β, IL8, IL10, IL12α, IL18, IL23, TNFα, TGFβ1), транскрипционные факторы (GATA3, RORC), толл-подобные рецепторы (TLR2, TLR4) и поверхностные маркеры клеток иммунной системы (CD45, CD68, CD69) – с использованием наборов реагентов производства ЗАО «ДНК-Технология».

Нормировка результатов ПЦР-РВ мРНК генов иммунной системы осуществлялась методом сравнения пороговых циклов (метод ΔΔCq) этих генов по четырем референтным генам (B2M, GUSB, TBP и HPRT1), которые имеют относительно стабильный уровень экспрессии,и значению медианы уровня экспрессии в контрольной группе, которая принималась равной единице.

Результаты исследования количественного состава биоты в обследованных группах женщин представлены в таблице.

Состав биоты во влагалище в обследованных группах женщин
Условно-патогенные микроорганизмы Условно здоровые Вагинит N=215 Бактериальный вагинит N=55
1A контроль N=95 1В n=19 1с N=27
Факультативно-анаэробные микроорганизмы
Enterobacterium spp 1,1 5,3  0 14,9* 3,6
Streptococcus spp 5,3 10,5 7,4 20,5* 12,7
Staphylococcus spp  0 3,7 3,7 3,6
Облигатно-анаэробные микроорганизмы
Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp/ Porphyromonas spp 3,2 15,8* 11,1 37,7* 87,3*
Eubacterium spp 8,4 15,8 39,6* 43,7* 85,5*
Sneathia spp/ Leptotrichia spp/ Fusobacterium spp  0  0 3,7 6,5* 29,1*
Megasphera spp/ Veilonella spp/ Dialister spp  0  0 3,7 22,8* 41,8*
Lachnobacterium spp/ Clostridium spp 2,1  0 7,4 9,3* 27,3*
Mobiluncus spp/ Corynebacterium spp  0  0 3,7 9,3* 12,7*
Peptostreptococcus spp  0  0  0 14,9* 30,9*
Atopobium vaginae 2,1  0 3,7 14,4* 49,1*
Молликуты
Mycoplasma spp  0  0 3,7 1,9 9,1*
Ureaplasma spp  0 100* 29,6* 27,9* 34,5*
Грибы
Candida spp  0 100* 43,3*  0
Сочетанные формы 2,1 10,5 55,6* 61,9* 94,5*

* p < 0,05.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что у женщин с диагнозом вагинита, по сравнению с контрольной группой, увеличена доля энтеробактерий и стрептококков. Доля анаэробных УПМ увеличена как в группе пациенток с вагинитом, так и в группе пациенток с БВ. В то же время у пациенток при концентрации Ureaplasma spp > 104 ГЭ/мл достоверно увеличено отношение Gardnerella vaginalis / Prevotella spp / Porphyromonas spp по сравнению с контрольной группой и при этом отсутствуют клинические симптомы воспаления.

Для оценки воспалительной реакции в тканях урогенитального тракта у женщин с клиническим диагнозом вагинит или БВ было проведено исследование транскрипционного профиля ряда генов иммунной системы. Результаты представлены на рис. 2.

Возможности ПЦР при урогенитальных заболеванияхРис. 2. Транскрипционный профиль ряда генов иммунной системы при вагинитах и бактериальном вагинозе (относительно уровня экспрессии в контрольной группе)

В целом результаты исследования свидетельствуют об одинаковом направлении усиления и снижения уровней экспрессии одних и тех же генов иммунной системы в ответ на увеличение УПМ при БВ и вагините. Однако при вагините уровень изменений профиля транскрипции генов иммунной системы в слизистой влагалища более выражен, чем при БВ.

У пациенток с клиническим диагнозом вагинит при помощи ROC-анализа были установлены уровни количественных показателей транскрипции генов, характеризующие наличие воспалительной реакции. Все обследованные группы были проанализированы с точки зрения вероятности локальной воспалительной реакции в соответствии с этими границами. Результаты анализа представлены на рис. 3.

Возможности ПЦР при урогенитальных заболеванияхРис. 3. Вероятность локальной воспалительной реакции в исследованных группах (по уровню экспрессии комплекса генов иммунной системы, характеризующих наличие воспалительной реакции %) IА. Контрольная подгруппа (n=95), IВ. Ureaplasma spp более 104 ГЭ/мл (n=19), IС. Кандидоносительство (n= 27), II. Вагинит (n=215), III. Бактериальный вагиноз (n = 55).

Представленные на рис. 3 результаты свидетельствуют о том, что почти 50% женщин, имеющих клинический диагноз бактериальный вагиноз, и 40% женщин, не имеющих клинических симптомов заболевания, но у которых обнаружены ДНК Ureplasma в количестве > 104 ГЭ/мл, обнаруживают экспрессионный профиль молекулярных маркеров активации иммунной системы, соответствующий местному воспалению, аналогичный вагиниту.

Может показаться, что диагностика микробного состава и местной воспалительной реакции такими сложными, молекулярно-биологическими методами является избыточным и дорогостоящим исследованием. Однако возможности метода приобретают особое значение, когда необходимо диагностировать воспаление в труднодоступных биотопах, например в полости матки в случаях диагностики эндометрита или эндометриоза. Если новые возможности будут доступны в экономическом плане, они будут востребованы в диагностике воспалительных заболеваний, т. к. для правильной трактовки состояния пациента необходимо оценивать и этиологию инфекционного процесса, и реакцию организма на возбудитель.

Доступные комплексные лабораторные тесты с использованием ПЦР-РВ, количественный анализ биоты урогенитального тракта, объективная количественная оценка воспаления в конечном итоге обеспечат возможность перехода к персонифицированному лечению заболеваний урогенитального тракта у женщин.

Список использованной литературы

1. Кира Е.Ф., Муслимова С.З. Неспецифический вагинит и его влияние на репродуктивное здоровье женщины // Проблемы репродукции. 2008. Т. 5. С. 8–14.

2. Кисина В.И., Забиров К.И. Урогенитальные инфекции у женщин: клиника, диагностика, лечение. М: «Медицинское информационное агентство», 2005, 288 с.

3. Манухин И.Б., Сухих Г.Т., Савельева Г.М. Гинекология: национальное руководство . M: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 704 c.

4. Международная классификация болезней 10-го пересмотра (МКБ-10).

5. Anderson M.R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complaints // JAMA : the journal of the American Medical Association. 2004. Vol. 291. P. 1368–1379.

6. Amsel R., Totten P.A., Spiegel C.A. et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations // Am J Med. 1983. Vol. 74. P. 14–22.

7. Farage M.A., Miller K.W., Ledger W.J. Determining the cause of vulvovaginal symptoms // Obstetrical & gynecological survey. 2008. Vol. 63. P. 445–464.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Новые документы

Закупки по 44-ФЗ
Квалификация
Платные услуги
Популярное у экономистов медучреждений
Популярное у главных медсестер

Мероприятия





Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×