Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

214

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе состоит из нескольких этапов и позволяет идентифицировать уникальные для каждого пациента мишени.

Определение клональных реаранжировок

Для определения клональных реаранжировок использовались стандартные наборы меченных флуоресцентной меткой праймеров для генов дельта (TCRD), гамма (TCRG), бета (TCRB), цепей Т-клеточного рецептора, перестроек тяжелой (IGH) и легкой каппа (IGK) цепи IG в соответствии с протоколом BIOMED-2 (таблица).

Моноклональные образцы имеют одинаковую длину ПЦР-продуктов и регистрируются в виде одного пика (моноаллельная реаранжировка) или двух пиков (биаллельная реаранжировка). В случае поликлональности образцов регистрируется множество пиков в виде Гауссовского распределения ввиду разницы длины амплификатов. На данном этапе чувствительность выявления опухолевых клеток не превышает 10-1-10-2 (чувствительность варьирует для разных мишеней).

Мишень

Реаранжировки

TCRD

VD — JD / DD2 — JD/ VD — DD3/ DD2 — DD3

TCRG

VG — JG

TCRB

VB — JB /DB — JB

IGH

VH — JH / DH — JH

IGK

Vk — Jk / Vk — KDE / Intron RSS — KDE

В нашей лаборатории методом ПЦР с последующим проведением фрагментного анализа проводится определение минимальной резидуальной болезни (МРБ) у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). В качестве примера приведены результаты исследования образца костного мозга пациента К., 37 лет, с диагнозом В-ОЛЛ, у которого в дебюте заболевания были выявлены клональные реаранжировки по генам TCRD и IGH (рис. 1).

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 1. Данные фрагментного анализа продуктов амплификации генов TCRG, TCRB, TCRD, IGH, IGK. 1. Реаранжировок по генам TCRG не выявлено. 2. Реаранжировок по генам TCRB не выявлено. 3. Выявлены клональные реаранжировки по генам TCRD. 4. Выявлены клональные реаранжировки по генам IgH / VH-JH полные перестройки. 5. Реаранжировок по генам IgH / DH-JH неполные перестройки не выявлено. 6. Реаранжировок по генам IGK не выявлено

Гетеродуплексный анализ и секвенирование клональных продуктов

Для выделения моноклональных продуктов проводился гетеродуплексный анализ. Синтез ПЦР-продуктов для гетеродуплексного анализа выполняли с использованием немеченных праймеров. Полученные амплификаты подвергали денатурации при высоких температурах (95 °С в течение 5 мин) с последующей ренатурацией в течение 1 ч при температуре 40 °С (термоциклер BioRad, США). Элекрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле при комнатной температуре (50V, 6–8 ч), с последующей окраской геля бромистым этидием (30 мин). Гомодуплексы (клональные продукты) определяются в виде одной яркой полоски в области, соответствующей длине моноклонального продукта, в то время как гетеродуплексы определяются в виде мазка (рис. 2). Яркие полоски соответствующей длины, представляющие собой моноклональные продукты, вырезали из геля, помещали в пробирки типа Эппендорф, после чего добавляли деионизованную воду в количестве, необходимом для полного покрытия геля, и термостатировали при температуре 65 °С в течение 30 мин.

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 2. Гетеродуплексный анализ. А. Электрофореграмма ПЦР-продуктов: М — маркер молекулярного веса; п — поликлональный продукт; м — моноклональный продукт. B. Соответствующие результаты фрагментного анализа поликлонального и моноклонального продуктов амплификации

Секвенирование проводили с использованием набора Big Dye Terminator на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности генов сравнивали с последовательностями герминальных V-, D- и J-генов, опубликованных в электронных базах данных (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi и IMGT http://www.imgt.org), и находили нуклеотидную последовательность участка соединения V- D-J-генов — CDR3 участка (рис. 3).

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 3. Схема подбора пациент-специфичного праймера по генам тяжелой цепи IG (пациент К., 37 лет, В-ОЛЛ). А. Результат фрагментного анализа моноклонального продукта амплификации по генам тяжелой цепи I  G. В. Нуклеотидная последовательность клонального продукта. С. Уникальная для данной клональной реаранжирови CDR3 область. D. Последовательность прямогопациент-специфичного праймера. Е. Консенсусные последовательности обратного праймера и флюоресцентного зонда



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль