Перестройки гена ALK при немелкоклеточном раке легких

161

Активация гена ALK при его перестройках происходит в результате образования химерных генов, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма.

Роль транслокаций – перемещений генетического материала между генами, ведущих к формированию химерных структур, – в онкогенезе известна достаточно давно. Из 384 генов, являющихся доказанными участниками опухолевой трансформации, по данным Сангеровского института, как минимум 282 участвуют в реаранжировках при самых разнообразных опухолях [1]. Надо отметить, что в течение длительного времени транслокации считались более характерными для опухолей кроветворной системы и сарком, чем для новообразований эпителиоидной природы. В первую очередь это было связано с ограниченными возможностями существовавших цитогенетических методик. В последние годы, благодаря применению современных молекулярно-генетических методов, доказано, что хромосомные перестройки не только являются нередким событием при солидных опухолях, но и зачастую играют ведущую роль в их развитии и прогрессии [2, 3].

Обнаружение внутрихромосомной перестройки короткого плеча 2 хромосомы, что приводит к образованию химерного онкогена EML4/ALK при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), стало одним из важнейших шагов в расшифровке генома этого заболевания и расширении возможностей персонализации его лечения (рис.1). Исследования Soda и соавт., опубликованные в 2007 г. в журнале Nature, показали ведущую роль этого генетического нарушения в онкогенезе для небольшой подгруппы аденокарцином легких и предположили возможность блокирования химерного протеина с помощью ингибиторов тирозинкиназ [4].

Перестройки гена ALK при немелкоклеточном раке легких

Рисунок 1. Образование химерного онкогена EML4/ALK (по Thunissen E et al. Virchows Arch 2012)

Активация гена ALK при его перестройках происходит в результате образования химерных генов, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма. В такой ситуации ALK попадает под воздействие второго участника транслокации, становится независимым от своих лигандов и передает сигнал постоянно, нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки [5]. Так происходит при всех опухолях, в генезе которых принимает участие перестроенный ген: при анапластической Т-клеточной лимфоме, воспалительной миофибробластической опухоли, некоторых опухолях нервной системы, редких случаях плоскоклеточного рака пищевода и т. д. [6].

При НМРЛ наиболее часто выявляется химерный ген EML4/ALK. Его образование происходит в результате делеции, возникающей в коротком плече 2 хромосомы, и поворота 5’ части ближайшего соседа ALK, гена EML4, вокруг своей оси [4]. Таким образом, ALK попадает под влияние регулирующих последовательностей EML4 (рис. 2) и переходит в активное состояние. Как правило, в формировании транскрипта химерного гена участвует 20 (редко – 19) экзон ALK. Точка разрыва EML4 гораздо разнообразнее – описано как минимум 11 видов химерного транскрипта в зависимости от экзона этого гена, принимающего участие в его формировании [7].

Перестройки гена ALK при немелкоклеточном раке легких

Рисунок 2. Различные виды химерных транскриптов с участием гена ALK. (по Sasaki T etal, Eur J Oncol 2010). 

Доказано, что все виды EML4/ALK обладают одинаково выраженным онкогенным потенциалом, однако чувствительность различных видов химерного протеина к блокаторам тирозинкиназ может быть различной. Такие данные были получены при исследованиях in vitro, подтверждения этому in vivo пока нет [8]. Известны также другие гены-партнеры ALK: KIF5B, TGF, KLC1. Частота таких транслокаций невелика и составляет не более 10,0%.

Одним из путей блокирования активированных тирозинкиназ является использование малых молекул-ингибиторов, структура которых подбирается таким образом, чтобы как можно эффективнее заблокировать ту часть протеина, которая участвует в связывании энергетической молекулы, и прекратить передачу сигнала [9]. Таким образом работают ингибиторы химерного протеина BCR-ABL при хроническом миелолейкозе и мутантного белка EGFR при НМРЛ. При перестройках гена ALK высокую эффективность показал кризотиниб – препарат, который разрабатывался как сочетанный блокатор протеинов MET и ALK. Уже в экспериментах in vitro было обнаружено, что его минимальные ингибирующие концентрации, вызывающие апоптоз клеток, экспрессирующих EML4/ALK, очень низки, что позволило быстро перейти от доклинических испытаний к клиническим и подтвердить выраженное противоопухолевое действие препарата. Полученные результаты позволили провести процедуру быстрой регистрации препарата для клинического использования в Федеральном управлении по контролю над продуктами и лекарствами США (FDA), не дожидаясь результатов III фазы исследований [10].

Демографические и клинико-лабораторные характеристики пациентов с перестройкой гена ALK

Известен ряд признаков, ассоциирующихся, по данным ранее проведенных исследований, с высокой частотой встречаемости перестроек гена ALK. В первую очередь, имеет значение гистологическая форма опухоли. Практически все случаи реаранжировки гена ALK обнаружены у больных с аденокарциномой, хотя встречаются единичные сообщения о выявлении перестроек в опухолях с гистологическими признаками плоскоклеточного рака [11]. Более чем в 50,0% реаранжированных случаев обнаруживается преимущественно солидная или ацинарная структура опухоли, гораздо реже – чешуйчатая, и крайне редко – муцинозная форма аденокарциномы. В 70,0–75,0% случаев выявляется присутствие перстневидных клеток. В целом, частота встречаемости перестроек ALK при всех формах аденокарцином составляет от 3,0 до 14,0% в зависимости от особенностей выборки [13]. Такие существенные различия связаны, в первую очередь, с фактором, влияющим на частоту встречаемости транслокаций ALK при НМРЛ, – курением. Около 56,0% реаранжировок встречается у некурящих пациентов с НМРЛ [14]. Согласно опубликованным данным, частота выявления перестроек ALK у некурящих больных НМРЛ составляет от 13,7 до 20,0% [15, 16]. Другими факторами, влияющими на частоту встречаемости этого генетического нарушения, являются молодой возраст больных и отсутствие конкурентных генетических нарушений, таких как мутации генов EGFR и KRAS. Селекция выборки по всем упомянутым критериям позволяет увеличить возможность выявления транслокаций ALK до 45,0%, однако ценой такой селекции будет потеря почти 50,0% пациентов с перестройками исследуемого гена, которые попадут в исключенные из исследования группы [17]. В связи с этим общепринятым подходом к выбору пациентов, направляемых на определение перестроек гена ALK, является отбор больных с гистологически доказанной аденокарциномой. Правомерность такого подхода подтверждается не только результатами клинических исследований, но и фармакоэкономическими расчетами [15].

Методы, используемые для обнаружения реаранжировок ALK

Общепризнанным методом выявления перестроек гена ALK является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Наиболее широко используется рекомендованная FDA методика с использованием набора LSI ALK Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular, США) [18]. Набор представляет собой два флуоресцентных зонда, конъюгированных с красителями разного цвета (оранжевым и зеленым) и комплементарных расположенным рядом последовательностям гена ALK. В норме оба зонда гибридизуются рядом и формируют сигнал желтого цвета или расположенные вплотную два сигнала красного и зеленого цвета, которые оценивают при применении флуоресцентного микроскопа. При перестройке гена и перемещении одной из его последовательностей сигналы расходятся и видны как лежащие раздельно. Такая методика позволяет распознать все виды перестроек гена ALK вне зависимости от партнера транслокации, что и является ее основным преимуществом. Для исследования могут быть использованы образцы гистологических срезов, цитологического материала, включая окрашенные архивные стекла. Недостатками метода являются его высокая стоимость и высокие требования к качеству образца и количеству опухолевых клеток в нем, поскольку для получения достоверного результата необходимо просмотреть не менее 50 ядер. Тем не менее, в США назначение кризотиниба невозможно без подтверждения транслокации методом FISH.

Другим, также теоретически универсальным методом является иммуногистохимическое исследование (ИГХ), позволяющее выявить высокую экспрессию химерного протеина в цитоплазме опухолевых клеток. Метод может быть быстро внедрен в практику и относительно недорог. Однако антитела, входящие в состав разработанных наборов для диагностики анапластической лимфомы, распознают не все конформационные формы протеина, возникающего в результате перестроек гена ALK при НМРЛ. Кроме того, экспрессия химерных протеинов при НМРЛ в ряде случаев достаточно слаба, а сам белок нестоек [19]. Тем не менее, в последнее время достигнуты существенные успехи в усовершенствовании методики – разработан новый клон антител (D5F3, Cell Signalling), появились новые системы детекции с возможностями значительного усиления сигнала [20]. Применение новых реагентов позволяет добиться практически 100,0% чувствительности в выявлении случаев с перестройкой гена ALK.

Третьим методом, используемым в диагностике реаранжировок ALK, является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Метод обладает высочайшей чувствительностью, позволяет работать с образцами, содержащими крайне низкое количество опухолевых клеток, способен сразу идентифицировать тип перестройки. Тем не менее, ОТ-ПЦР обладает несколькими существенными недостатками. Во-первых, метод очень требователен к качеству РНК, в особенности выделенной из фиксированного в формалине и залитого в парафин образца. Во-вторых, с помощью конкретного набора с использованием ОТ-ПЦР возможно выявить только те типы перестройки гена ALK, к которым подобраны специфические праймеры, что требует мультиплицирования исследования и существенных временных затрат. Достоинства и недостатки перечисленных методов отражены в таблице.

Методы, используемые для идентификации перестроек гена ALK
(по Murakami et al, Frontiers in Oncol, 2012)

Метод

Достоинства

Недостатки

FISH

Универсальный прямой метод, «золотой стандарт» клинических исследований, пригоден для архивных блоков и стекол

Дорогой метод, довольно длительный в исполнении, возможно, не всегда достаточно чувствительный

ИГХ

Потенциально универсальный метод, дешевый, доступный в большинстве лабораторий, быстрый, пригоден для архивных тканей

Метод непрямой, зависим от клона антител и систем детекции, возможны ложнонегативные и ложнопозитивные результаты

ОТ-ПЦР

Потенциально быстрый, очень чувствительный метод, позволяющий точно идентифицировать химерный транскрипт

Не всегда применим для архивных тканей, не способен идентифицировать редкие транскрипты, не входящие в состав набора

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ, ИГХ – иммуногистохимический метод, ОТ-ПЦР – обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

Исследования генетической структуры злокачественных опухолей с целью поиска аберраций, потенциально чувствительных к терапии таргетными препаратами, продолжают интенсивно развиваться. Конечной целью этих исследований в будущем является определение индивидуального генетического портрета каждой опухоли и подбор индивидуального сочетания лечебных воздействий для каждого пациента. Выявление группы больных НМРЛ с перестройками гена ALK позволяет уже сейчас приблизиться к персонализации лечения, существенно увеличив эффективность терапии для этой, ранее практически некурабельной, категории пациентов. 



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль