Импедансная агрегатометрия в контроле аспиринопрофилактики сосудистых тромбозов

286

Возможность исследования агрегации тромбоцитов в цельной крови появилась с появлением агрегометров, основанных на технологии импеданса. Сейчас доступны агрегометры, сочетающие оптический принцип, импедансометрию и люминесцентную детекцию.

Активация тромбоцитов играет ключевую роль в формировании тромбов при атеросклеротическом поражении артерий, а также в патогенезе микроциркуляторных расстройств при тромбоцитозах. Среди средств, препятствующих избыточной агрегации тромбоцитов, наиболее доступным и эффективным препаратом остается ацетилсалициловая кислота (АСК) [1]. В известном мета-анализе приведены данные о снижении смертности от инфаркта миокарда или инсульта примерно на 25% при применении антитромбоцитарной терапии АСК, по сравнению с плацебо [2]. В соответствии с международными и отечественными рекомендациями, АСК является наиболее широко используемым препаратом также и для профилактики осложнений тромбоцитемии у пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями (ХМПЗ) [3]. Такие пациенты часто страдают от развития тромбозов и могут быть госпитализированы в стационар с неатерогенными инфарктами и ишемическими инсультами.

С другой стороны, длительный прием аспирина может способствовать проявлению кровоточивости вплоть до геморрагических инсультов, особенно у пациентов с синдромом Виллебранда, который является противопоказанием к назначению аспирина [4]. Известно также, что тромбоцитозы при ХМПЗ часто обуславливают сниженную активность фактора Виллебранда (ФВ).

Обнаруженная высокая вариабельность ответа тромбоцитов на действие антиагрегантов обуславливает необходимость объективной оценки степени индивидуальной чувствительности к антитромбоцитарному действию АСК. Согласно результатам [5, 6], аспиринорезистентность тромбоцитов встречается у 5–45% обследуемых пациентов и в значительной степени зависит от используемого метода диагностики. В связи с этим, крайне важен вопрос стандартизации используемых тестов для персонифицированного подхода к подбору оптимальной дозы и режима приема АСК.

Основной методологический прорыв в исследовании физиологии тромбоцитов произошел в начале 1960-х гг., когда Борн и О’Брайен независимо друг от друга разработали простой оптический метод измерения агрегации тромбоцитов. Оптический тест по-прежнему является наиболее широко используемым в рутинной практике выявления тромбоцитопатий. Возможность исследования агрегации тромбоцитов в цельной крови появилась с появлением агрегометров, основанных на технологии импеданса. Сейчас для клинических лабораторий доступны агрегометры, которые сочетают оптический принцип, импедансометрию и люминесцентную детекцию для одновременного измерения интенсивности агрегации и секреции гранул тромбоцитов.

В России наиболее популярны агрегометры фирмы БИОЛА и Солар. Преимуществом этих приборов является возможность анализа размерности тромбоцитарных микроагрегатов. Ultegra-RPFA – еще один прибор, действие которого основано на применении метода иммунотурбидиметрии с оптической системой детектирования. Эта модификация агрегометрического прибора изначально разрабатывалась как система мониторинга действия антитромбоцитарных препаратов. Исследование не требует транспортировки проб и длительного ожидания результатов. В последние годы получил распространение аппарат для измерения агрегации, называемый «The Verify Now System» или «VerifyNow». Действие прибора также основывается на анализе светопропускания, но для исследования используется цельная кровь, и при этом весь процесс – от взятия крови до получения результатов – может быть проведен у постели больного в течение 10–15 мин. Все большее применение находит прибор – «анализатор функции тромбоцитов» (Platelet Function Analyser, PFA-200). В этом приборе цельная кровь пропускается через картридж с индукторами агрегации. Фактически измеряется не адгезия или агрегация тромбоцитов, а суммарная интенсивность всего процесса тромбоцитарного гемостаза. Вместе с тем, появились данные, что этот метод не обладает достаточной чувствительностью для измерения антитромботических эффектов таких препаратов, как ацетилсалициловая кислота и антагонисты АДФ-рецептора [7]. Не последнее место в выборе оптимального метода занимает и вопрос качества и стоимости используемых реактивов. Поэтому весьма актуальна адаптация технологии исследования к реагентам отечественных производителей.

Хотя самый распространенный оптический метод агрегометрии и имеет доказанное диагностическое значение, очевидны и его серьезные ограничения. Во время предварительного центрифугирования проб эритроциты, лейкоциты и крупные тромбоциты удаляются из образца. Эти клетки крови – важные регуляторы активности тромбоцитов, т. к. могут потреблять адениновые нуклеотиды, синтезировать и высвобождать простагландины и связывать простациклины [8, 9]. Вещества, которые регулируют функцию тромбоцитов: простациклин, циклический АМФ – могут деградировать до биологически неактивных продуктов во время центрифугирования. Кроме того, в плазме не наблюдается эффектов межклеточного взаимодействия тромбоцитов с лейкоцитами и эритроцитами, что также искажает нативные условия функционирования тромбоцитов.

Метод импедансной агрегометрии в цельной крови обходит эти проблемы, поскольку проба исследуется без предварительного центрифугирования, в присутствии всех форменных элементов. Было показано, что данный метод высокочувствителен к антитромбоцитарному действию АСК [10, 11]. Для агрегометра Chrono-Log нами были оптимизированы условия проведения теста инкубации пробы крови с АСК и последующей импедансной агрегометрии для определения характера изменения чувствительности тромбоцитов к препарату, а также выявлены гендерные отличия параметров агрегации у здоровых лиц [11, 13].

С целью определения возможности импедансной агрегометрии в оценке чувствительности тромбоцитов к АСК было обследовано: 50 больных ишемическим инсультом; 30 больных, перенесших геморрагический инсульт; 67 пациентов с выявленной мутацией V617F в гене янускиназы-2 (JAK2); 120 пациентов с ХМПЗ без мутации JAK2; а также 28 здоровых доноров. Индукция осуществлялась АДФ (НПО «Ренам», Россия) в конечной концентрации 5 мкМ и ристомицином (НПО «Ренам», Россия) в конечной концентрации 1 мг/мл. Оценка агрегации проводилась в пробах до и после предварительной 15 мин инкубации цельной крови с АСК в конечной концентрации 0,1 мМ [14]. Функцию тромбоцитов оценивали по параметру амплитуды – максимальному подъему агрегационной кривой. Уровень ФВ определяли на автоматическом коагулометре ACL TOP (IL) с комплектом реагентов VON WILLEBRAND KIT/AG (HemosIL, США) и с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа «Technozym vWF:Ag ELISA» и фотометра Bio-Rad, модель 680.

Исследование проводилось в рамках одобренного локальным этическим комитетом регистра «Генетические факторы риска тромбоза у жителей, проживающих на территории РФ, клиническое фенотипирование и тромбопрофилактика тромбоэмболических осложнений в онтогенезе» [15].

Статистическую обработку данных производили с помощью пакета программ Statistica 10.0, результаты представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (С2575). Учитывая отсутствие нормального распределения в большинстве вариационных рядов, значимость отличий в несвязанных выборках оценивали с помощью критерия Манна – Уитни. Наличие корреляционной связи оценивали с применением ранговой корреляции Спирмена. Различия оценивали как статистически значимые, при p < 0,05.

Как известно, правильную диагностическую информацию с помощью лабораторных исследований можно получить, опираясь на нормальные величины данного лабораторного теста, пределы внутри- и межиндивидуальных биологических колебаний и учитывая влияние на них различных факторов [16]. Результаты многих лабораторных исследований используются не столько для первичной диагностики, сколько для наблюдения за динамикой состояний пациентов, а в качестве инструмента мониторинга референтные интервалы в ряде случаев непригодны. Пациенты могут иметь необычные для себя результаты тестов, тем не менее, не выходящие за расчетные референсные пределы. Поэтому мы начали исследование с определения коэффициентов меж- и внутрииндивидуальной вариации параметров импедансной агрегометрии, полученных при обследовании здоровых доноров (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициенты вариации параметров импедансной агрегометрии при АДФ-индукции до и после инкубации с ацетилсалициловой кислотой у здоровых лиц

Параметр

Амплитуда

Скорость

Лаг-фаза

Площадь

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

Коэффициент межиндивидуальной вариации, %

35,7

64,0

38,0

50,4

39,2

51,8

38,3

67,4

Коэффициент внутрииндивидуальной вариации, %

5,8

11,2

18,8

20,7

15

24,3

10,0

16,1

Индекс индивидуальности

0,2

0,2

0,5

0,4

0,4

0,5

0,3

0,2

Примечание: Индекс индивидуальности вычисляется как отношение коэффициентов внутри- и межиндивидуальной вариации [16].

Коэффициент внутрииндивидуальной вариации для всех параметров после инкубации с АСК был выше, чем до инкубации, что может быть связано как с увеличением аналитической ошибки теста in vitro, так и с индивидуальными особенностями реакции тромбоцитов на АСК. Индекс индивидуальности для всех параметров импедансной агрегометрии оказался ниже 0,6, что свидетельствует о высокой индивидуальной вариабельности показателей и ограничивает применение референтных интервалов [16]. Таким образом, измерение агрегации в большей степени будет полезно для мониторинга состояния функциональной активности тромбоцитов в сравнении с данными предыдущих измерений. Поэтому оценка эффективности действия препарата должна проводиться до и после начала его использования.

Вместе с тем, в рутинной практике клинических лабораторий провести такое исследование, которое требует неоднократного повторного визита пациента, весьма проблематично.

Одновременно среди принимающих аспирин достаточно часто выявляются пациенты с существенно сниженной агрегацией – вплоть до полного отсутствия регистрации импеданса. Это может быть следствием повышенной реакции тромбоцитарного гемостаза на АСК и чревато высоким риском геморрагий.

При проведении теста предварительной инкубации проб крови с АСК in vitro нивелируется влияние возможных индивидуальных фармакокинетических особенностей: всасывания, распределения и метаболизма препарата – и можно сделать заключение о наличии аспиринорезистентности, обусловленной непосредственно тромбоцитарными функциями в условиях интактного клеточного окружения цельной крови.

Согласно полученным данным, и среди здоровых лиц, и среди пациентов с инсультом и ХМПЗ полностью отсутствовал эффект АСК in vitro, что свидетельствует об аспиринорезистентности их тромбоцитов, по всей видимости, обусловленной ЦОГ-1-независимым механизмом агрегации тромбоцитов. Поскольку лишь у единичных пациентов в нашей выборке (менее 1% обследованных) АСК не ингибировала эффект субстрата ЦОГ арахидоновой кислоты, можно полагать, что АСК практически всегда ингибирует активность ЦОГ тромбоцитов, но АДФ может индуцировать агрегацию и независимым от ЦОГ-1 путем. Вероятно, у данных лиц ЦОГ-независимые механизмы отличаются высокой активностью и компенсируют ингибирование ЦОГ-1 аспирином. В этом случае, очевидно, эффективным будет назначение, наряду с аспирином, блокаторов АДФ-рецепторов.

Выявлены пациенты с относительно высоким эффектом АСК, что является серьезным основанием ограничить дозу аспирина или заменить его другим дезагрегантом в связи с вероятностью развития геморрагических осложнений. Очевидно, данная реакция может усугубляться дефицитом ФВ.

Оценка значений эффекта АСК у пациентов с низким и высоким уровнем ФВ показала, что у пациентов с низкой концентрацией и активностью фактора наблюдается значительное увеличение эффекта АСК in vitro, что свидетельствует о повышенной чувствительности к аспирину и высокой вероятности возникновения кровотечений на фоне терапии. Напротив, у пациентов с высокими значениями концентрации ФВ отмечается относительно сниженная реакция на АСК, что может быть одним из факторов аспиринорезистентности.

Вместе с тем, один из важных аспектов функциональной активности тромбоцитов – секреция содержимого гранул – не регистрируется импедансометрией. Дефекты секреции тромбоцитов клинически могут проявляться в виде кровотечений, хотя при этом агрегация может оставаться в пределах нормальных значений. Оценка таких дефектов особенно актуальна для пациентов с ХМПЗ, когда вследствие приобретенной мутации могут возникать морфологические изменения клеток. Вполне очевидно, что для полной диагностики состояния тромбоцитов и чувствительности к АСК in vitro необходим комплексный метод оценки агрегации. Нами был предложен способ определения чувствительности тромбоцитов к аспирину, основанный на применении метода люминесценции в цельной крови [17]. Получая одновременно результат агрегации и секреции гранул, а также отслеживая изменение этих параметров в ответ на добавление АСК, можно охарактеризовать функциональное состояние кровяных пластинок и подобрать оптимальную схему лечения, не вызывающую побочных эффектов.

Таким образом, импедансный метод агрегации тромбоцитов в цельной крови является наиболее приближенным к реальным физиологическим условиям. При этом особенно важное значение имеет индивидуальный мониторинг функции тромбоцитов и сравнение полученных значений с предыдущими значениями данного пациента. Альтернативный вариант для оценки эффективности дезагрегантов заключается в использовании фармакологических тестов последовательной инкубации проб цельной крови с препаратом. У пациентов с ХМПЗ и острыми нарушениями мозгового кровообращения наблюдается существенный разброс параметров агрегации на фоне АСК: от случаев полной резистентности до полного подавления агрегационной активности тромбоцитов. Эти данные подтверждают актуальность персонализированного подхода с целью оперативной оценки эффективности и уровня риска при назначении дезагрегантов. Дополнительный тест, отражающий активность ФВ, может быть полезным прогностическим критерием в комплексе с агрегометрией, его низкий уровень свидетельствует о противопоказании к назначению АСК.

Перспектива увеличения диагностического потенциала импедансной агрегометрии заключается в проведении сочетанной оценки агрегации и интенсивности освобождения гранул при использовании люминесцентной технологии.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×