3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекция

105

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови при мониторинге ВИЧ-инфекции

Методические рекомендации

7.3.3. Стратегии гейтинга для подсчета CD4-Tлимфоцитов. Гейтирование.

Гейт (логическое ограничение) — граница, позволяющая исследовать клетки только интересующей нас популяции.

Определение положения клеточных популяций и гейта на основе двух морфологических параметров носит название гомогенный гейтинг или гейтирование по светорассеянию (рис. 8).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 8. Гистограммы для подсчета CD4 Т-лимфоцитов с гейтированием по каналам светорассеяния (FS, SS)

Гейтирование лимфоцитов по каналам светорассеяния

Гейтирование по каналам светорассеяния требует соблюдения обязательных условий:

требуются показания двух приборов;кровь должна быть свежая, не позднее 6 часов от момента забора;полный лизис эритроцитов, при безотмывочном методе;строгое соблюдение температурного режима 18–23 °С.

При не соблюдении этих условий невозможно выделить популяцию лимфоцитов (рис. 9).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 9. Изменение морфологических параметров клеток периферической крови при неправильном хранении исходного образца. Дегрануляция и уменьшение размеров гранулоцитов ( С. В. Хайдуков, 2011 г.): 1 — анализ образца свежей периферической крови; 2 — анализ образца периферической крови после неправильного хранения

Кроме того, у ВИЧ-инфицированных пациентов картина светорассеяния лейкоцитов отличается от картины светорассеяния лейкоцитов здоровых лиц. Одна из причин — изменение морфологии клеток при ВИЧ-инфекции (рис. 3), плохое разделение между мелкими и крупными клетками.

Гейтирование, основанное на сочетание собственного клеточного и внешнего параметров (морфологической характеристики и флуоресцентного окрашивания) носит название «гетерогенный гейтинг». Для этого используют специфический лейкоцитарный маркер CD45, который присутствует на всех лейкоцитах крови, в сочетании с боковым светорассеянием (рис. 10).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 10. Гейтирование лимфоцитов по CD45 в сочетании с боковым светорассеянием (SS). В данном случае гейт, А — выбор популяции лимфоцитов на рис. 10А. Вторая гистограмма (Б) — двухпараметрическая, построена с указанием гейтирования из гейта, А и расположением CD3 и CD4 положительных клеток

Гейтирование по CD45 в сочетании с боковым светорассеянием имеет ряд преимуществ:

позволяет четко идентифицировать все лейкоциты;эффективно отделять лейкоциты от дебриса, даже в случае неполного лизиса эритроцитов;сроки хранения образца увеличиваются до 48 часов, при условии соблюдения режима хранения и транспортировки, если в этом есть необходимость (рис. 11).3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 11. Влияние длительности хранения образца на картину светорассеяния (F. Mandy, 2004 г.)

Двухъякорный гейт

Двухъякорный гейт позволяет определить правильную форму гейта даже при плохом разделении популяций.

Гейт, А включает все лимфоциты и небольшое количество контаминанта. Гейт В включает все CD3 клетки. Гейт С включает CD45 CD3 клетки и должен содержать не менее 97% клеток. Контаминация моноцитами в первом квадрате не должна превышать 3%.

При одноплатформенной технологии подсчета абсолютного количества клеточных популяций необходимо построить еще один негейтированный график или гистограмму для определения количества частиц, а также гистограмму, гейтированную по, А и В для получения результата абсолютного счета (рис. 12–14).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 12. Пример 1. Двухъякорный гейт. (Bergeron et all., 2002 г.)3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 13. Пример 2. Двухъякорный гейт. Рабочий протокол. Одноплатформенный метод3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 14. Пример 3. Алгоритм выбора зоны анализа лимфоцитов при использовании логических ограничений по CD45 и морфологическим параметрам. (Хайдуков С.В., 2005 г.)

Вводится логическое ограничение по SS и CD45 для лимфоцитов. Логическое ограничение, А вводится в гистограмму SS x FS.

7.3.4. Исследование образца на проточном цитофлуориметре.

Протоколы создаются согласно программному обеспечению используемого прибора. Подсчет абсолютного количества клеточных популяций можно проводить двумя методами.

1. Непрямой или двухплатформенный метод для вычисления абсолютного количества клеток сочетает результаты, полученные на гематологическом анализаторе и проточном цитофлуориметре с использованием формулы, приведенной в таблице 6.

Таблица 6

Расчет абсолютного количества клеток в образце периферической крови

Данные полученные на гематологическом анализаторе Общее количество лейкоцитов (А): например, А = 5, 0×109/л % лимфоцитов (Б): например Б = 35%
Данные, полученные при исследовании образца на цитофлуориметре Относительное количество CD4 Т-лимфоцитов ©: например С = 20%
Найти абсолютное количество лимфоцитов (Х) Х = А x Б / 100%; Пример Х = (5, 0×109) x 35% / 100% = 1, 75×109
Найти абсолютное количество CD4 T-лимфоцитов (Y) Y = Х x С / 100%; Пример Y = (1, 75×109/л) x 20% / 100% = 0, 35×109
В данном примере абсолютное количество CD4 Т-лимфоцитов 350 клеток в 1 мкл крови

2. Прямой или одноплатформенный метод с использованием частиц для абсолютного счета. Метод основан на добавлении к образцу частиц известной концентрации. Частицы добавляются в готовую пробу (например, частицы FlowCount) или используются пробирки с уже добавленными частицами (пробирки TruCount). В таблице 7 представлены достоинства и недостатки обоих методов.

Таблица 7

Сравнительная характеристика методов подсчета абсолютного количества клеток

Двухплатформенный метод Одноплатформенный метод
Приборы: гематологический анализатор и цитофлуориметр Приборы: цитофлуориметр
Результат складывается из 3 значений — больше погрешность Абсолютное количество клеток определяется напрямую — более точный результат
Для исследования необходима свежая кровь — до 6 часов от момента взятия пробы В сочетании с CD45 позволяет исследовать образцы в течение 48 часов и при неполном лизисе эритроцитов
В случае плохого лизиса можно получить некорректные результаты Требует высокой точности дозирования

В зависимости от используемых прибора и программы, исследования по определению количества CD4 Т-лимфоцитов можно проводить в автоматическом режиме или создавать протоколы для исследования вручную.

Рекомендации по общим правилам

Создайте гистограмму для выделения популяции лимфоцитов (рис. 14, 15).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 15. Четырехцветный анализ

Далее строится двухпараметрический график, разделенный на четыре квадранта, например, CD4-окрашенные РЕ, CD3-окрашенные РС5.

Так как моноциты являются положительными клетками по CD4, а CD3 — отрицательными, то контаминация моноцитами в 1 квадранте не должна превышать 3%.

Для подсчета количественного CD4 и CD8 Т-лимфоцитов необходимо использовать трех- и четырехцветное окрашивание, так как моноциты положительны по CD4, а натуральные киллеры по CD8.

При четырехцветном окрашивании строится еще один график по CD3 и CD8, разделенный на четыре квадранта. На графиках необходимо установить визир таким образом, чтобы негативная и окрашенная популяции были отделены друг от друга. Исследуемые популяции CD3CD4 и CD3CD8 будут отражены во вторых квадрантах на соответствующих графиках. Процентное содержание исследуемой популяции клеток и соответствующее ей количество событий будет отображено в таблице статистики для данного графика по окончании сбора данных.

При одноплатформенном методе подсчета абсолютного количества клеточных популяций необходимо построить еще один негейтированный график или гистограмму для определения количества частиц. Частицы разных производителей имеют разную интенсивность флуоресценции. Необходимо выбрать детектор флуоресценции, который даст наилучшее разрешение между клетками и частицами. Нарисуйте гейты для частиц.

Количество частиц в гейте по окончании сбора данных будет отображено в таблице статистики данного графика (гистограммы).

График 1. CD45 x SS.

Установите порог (ограничитель) на детекторе флуоресценции, которым регистрируется CD45, как можно ближе к популяции лейкоцитов. Настройте боковое светорассеяние таким образом, чтобы все популяции лейкоцитов были видны на графике и хорошо отделялись друг от друга. Нарисуйте гейт [R1; А]2 вокруг лимфоцитов — ярких CD45-положительных клеток со слабым боковым светорассеянием (рис. 14, 15). Постарайтесь включить все лимфоциты и избежать попадания в гейт моноцитов, имеющих более слабое окрашивание по CD45 и более высокое боковое светорассеяние, а также базофилов, имеющих менее яркое свечение по CD45 и слабое боковое светорассеяние.

Для получения точных абсолютных значений необходимо подсчитать не менее 2500 лимфоцитов в каждом образце.

Чистота гейта и полнота включения лимфоцитов

При гейтировании по СD45 в сочетании с боковым светорассеянием чистота гейта, как правило, оптимальна. При использовании многоцветной панели моноклональных антител чистоту гейта и степень контаминации моноцитами можно оценить по двухпараметровому графику CD3/CD4. Моноциты являются CD4-положительными и CD3-отрицательными. Контаминация моноцитами не должна превышать 3%.

Оценить полноту включения лимфоцитов можно только в том случае, если исследуемая панель содержит маркеры Т, В и NK клеток.

Графики 2 и 3; гейт [R1; A] (рис. 15, 16)

Установите визир таким образом, чтобы негативная и окрашенная популяции были отделены друг от друга. Исследуемые популяции клеток CD3CD4 и CD3CD8 будут отображены в квадранте [UR; B2, C2] на графиках 2 и 3 соответственно. Процентное содержание исследуемой популяции клеток и соответствующее ей количество событий будет отображено в таблице статистики для данного графика по окончанию сбора данных.

График 4 или гистограмма 5

Определите количество частиц, используя негейтированный график или гистограмму. Частицы разных производителей имеют разную интенсивность флуоресценции. Выберите детектор флуоресценции, который дает наилучшее разрешение между клетками и частицами. Нарисуйте гейт [R2; D]3 для частиц. Количество частиц в гейте по окончанию сбора данных будет отображено в таблице статистики для данного графика (гистограммы).

Подсчет абсолютного количества CD4 Т-клеток осуществляется по формуле:3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекция

** Общее количество частиц указывается производителем на упаковке или в инструкции, прилагаемой к частицам

Подсчет абсолютного количества CD4 клеток (примеры)

FACSCalibur, частицы TruCount, общее количество частиц 49 930 (рис. 15):
3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекция

Epics XL, частицы FlowCount, количество частиц: 1058 в 1 мкл суспензии (рис. 16):
3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекция

Производители проточных цитометров предлагают программное обеспечение, облегчающее подсчет абсолютного количества клеток.

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 16. Четырехцветный анализ

Таким образом, настройка рабочего протокола складывается из:

проверки работы проточного цитофлуориметра;настройки дискриминатора;настройки каналов светорассеяния;настройки каналов флуоресценции;введения коэффициентов компенсации.

8. Контроль качества исследования субпопуляционного состава клеток периферической крови на проточных цитофлуориметрах

Правильные результаты исследования клеточных популяций периферической крови зависят от:

А. разработки стандартных операционных процедур;

Б. внутреннего контроля качества проводимых процедур;

В. внешнего контроля качества проводимых процедур.

Стандартизация и обеспечение качества исследований субпопуляционного состава клеток периферической крови на проточных цитофлуориметрах включает:

1. Определение границ нормы клеточных популяций периферической крови для каждого региона, для каждой лаборатории.

2. Проверку состояния прибора.

3. Стандарт по проведению подсчета клеток на проточном цитофлуориметре.

4. Использование контрольных образцов.

5. Участие в программах внешнего контроля качества.

8.1. Определение границ нормы клеточных популяций периферической крови для каждого региона и для каждой лаборатории

Известно что, количество клеточных популяций и субпопуляций лимфоцитов зависит от региона проживания и воздействия различных неблагоприятных воздействий экологических факторов на организм. Так, например, в районе Семипалатинска значительно снижено количество лимфоцитов и Т-лимфоцитов. В районах западной Сибири выше количество натуральных киллеров и ниже Т- и В-лимфоцитов, чем в центральных районах европейской части России.

Поэтому каждая лаборатория должна определить свои референтные значения для исследуемых клеточных показателей в соответствии с местом расположения.

Для определения надежных референтных границ нормы необходимо обследовать достаточное количество «нормальных» здоровых доноров (здоровый образ жизни, отсутствие хронических и острых заболеваний, отсутствие лечения, нормальный общий анализ крови). Сгруппировать их по полу и возрасту. Исследование от момента забора пробы до выдачи результата должно проводиться в одинаковых условиях.

8.2. Внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований

Внутрилабораторный контроль качества это системная процедура, выполняемая в лаборатории ежедневно с целью оценки точности и правильности проводимых исследований и предупреждения ошибок на всех этапах подготовки и анализа образца. Всесторонний контроль качества включает контроль состояния прибора, процесса подготовки и исследования образца.

8.2.1. Состояние прибора

Оптическая настройка

Большинство современных проточных цитометров имеют фиксированную оптическую систему, и не требуют настройки. Однако пользователю проточного цитофлуориметра настоятельно рекомендуется ежедневно использовать стандарты настройки, для того чтобы убедиться в правильности оптической настройки и системы потока жидкости прибора. При исследовании стандартов настройки пики на графике, соответствующем каждому детектору, должны быть максимально яркие, узкие и гомогенные, CV < 2%. Положение пика на графиках должно соответствовать ранее установленным целевым значениям. Смещение пика может свидетельствовать о загрязнении или попадании пузырей воздуха в систему потока жидкости, а также о неисправности прибора. Увеличение ширины пика свидетельствует об ухудшении разрешения популяций.

Параметры состояния прибора

Параметры состояния, такие как линейность, чувствительность и динамический диапазон прибора, можно определить по калибровочному графику и использовать для контроля состояния прибора. Для этого используются стандарты калибровки. Некоторые производители предлагают программное обеспечение для обработки данных калибровки и построения калибровочных графиков.

Настройка проточного цитофлуориметра

Удобным и продуктивным методом стандартизации настроек прибора является использование целевых каналов. Для этого применяют стандартные (референтные) образцы.

Настройте напряжение ФЭУ и цветовую компенсацию как описано в предыдущих разделах. Используя полученные настройки, исследуйте референтные стандарты. Положение пика на графиках (MdX) является вашим целевым каналом. Запишите значение целевого канала для каждого детектора и соответствующие им значения напряжения ФЭУ. Эти настройки определяют положение окна анализа для данного исследования. Регулярно анализируйте референтные стандарты и контролируйте положение пика на графиках. Значение MdX для каждого детектора должно быть сходным изо дня в день. Регулируйте напряжение ФЭУ таким образом, чтобы референтные стандарты попадали в целевой канал. Значительное смещение пика на графике может свидетельствовать об изменениях в системе потока жидкости (грязь, пузырьки воздуха) или о неисправности фотоэлектронных умножителей.

8.2.2. Подготовка образца

Дозирование

При использовании одноплатформенной технологии подсчета абсолютного количества CD4 Т-лимфоцитов точность дозирования крови и частиц для абсолютного счета является необходимым условием для получения правильных абсолютных значений. Для того чтобы быть уверенным в точности дозирования, необходимо осуществлять контроль процедуры дозирования и состояния пипетки.

Точность дозирования можно оценить следующим образом.

Дозируйте 100 мкл дистиллированной воды, используя методику обратного дозирования, взвесьте и запишите вес. Повторите процедуру десять раз, подсчитайте среднее значение и коэффициент вариации (CV). При комнатной температуре вес 100 мкл воды составляет 0, 1000 г., среднее же значение должно быть между 0, 0980 и 0, 1020 г., а CV < 2%. Важную роль играет выбор наконечников для пипетки, температура дозируемых веществ и помещения.

Скорость потока частиц.

При использовании одноплатформенной технологии существует дополнительный способ оценки правильности дозирования. Поскольку теоретически все образцы содержат одинаковое количество частиц, скорость потока частиц является относительно постоянной. Подсчитать скорость потока частиц (количество частиц в секунду) можно разделив количество частиц, собранных во время исследования образца, на время анализа. Коэффициент вариации скорости потока частиц от образца к образцу должен составлять около 5%. Если CV значительно превышает 5%, точность дозирования не является оптимальной. Если в отдельном образце скорость потока частиц значительно больше или меньше средней скорости, абсолютные показатели могут быть значительноскомпрометированы. Если в исследуемый образец добавлено больше частиц, результат будет ниже. Если объем добавленных части меньше объема крови, то результат будет завышен. В этом случае необходимо повторить подготовку и исследование образца.

Стабильность моноклональных антител.

Необходимо оценивать стабильность моноклональных антител при их титровании. Для этого свежую цельную кровь окрашивают моноклональными антителами и осуществляют мониторинг средней интенсивности флуоресценции в каждом последующем разведении.

Лизис и фиксация образцов.

Использование гейтирования по CD45 в комбинации с боковым светорассеянием позволяет осуществлять анализ даже в случае неполного лизиса эритроцитов в образце, так как CD45 позволяет эффективно отделить лейкоциты от эритроцитов, тромбоцитов и дебриса. Завершенность лизиса может быть оценена по графику с использованием гейта по светорассеянию (FS x SS).

8.2.3. Стабилизированные контрольные материалы

Для контроля правильности исследований можно использовать контрольные материалы — стабилизированную кровь с известным содержанием клеточных популяций. Разные производители предлагают готовую стабилизированную кровь или стабилизатор для приготовления контрольного материала.

Подготовьте образец, пользуясь вашими обычными методиками, и исследуйте его на проточном цитофлуориметре. Полученные значения сравните с предлагаемыми производителем. Рекомендуется регулярно исследовать контрольный материал и подсчитывать коэффициент вариации.

Свойства препаратов стабилизированной цельной (контрольной) крови:

характеристики светорассеяния сходны с характеристиками свежей цельной крови;характеристики флуоресценции отличаются от характеристик свежей цельной крови;проба готовится (окрашивается и лизируется) так же, как и при использовании свежей цельной крови. Оптимальная температура хранения 2 и 10 ºC.

Применение:

для контроля оценки точности определения абсолютного и относительного содержания клеток;материал для контроля качества в национальных и международных программах оценки качества (рис. 17).3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 17. Стабилизированная контрольная кровь (Bergeron et all., 2002 г.)

8.2.4. Аналитический контроль

Для аналитического контроля при фенотипировании клеток периферической крови используют значения суммы клеток.

Сумма лимфоцитов.

Общая сумма основных популяций лимфоцитов: Т-клетки (CD3), В-клетки (CD19) и NK-клетки (CD3-/CD16 или CD16), сумма всех популяций может служить дополнительным контролем правильности измерений и должна составлять 100 ± 5%.

Сумма Т-клеток.

В случае если исследуемая панель кроме CD4 включает CD8 и CD3, сумма процентного содержания CD4 CD3 и CD8 CD3 клеток должна быть равна процентному содержанию CD3 клеток ±5%. Сумма может быть меньше при высоком содержании в образце γδТ-клеток.

Репликаты Т-клеток

Если исследуемая панель включает более одной пробирки, содержащей одинаковый маркер (например, CD3), можно сравнить его содержание в разных пробирках. Разница не должна превышать 2%.

Окрашивание стабилизированного образца должно проводиться не реже одного раза в неделю и в следующих случаях:

при начале использования новой серии моноклональных антител;в случае получения некорректных результатов.

Все полученные результаты должны фиксироваться в отдельном журнале.

8.3. Внешний контроль качества проводимых исследований

Необходимым условием для всесторонней гарантии качества проводимых лабораторных исследований иммунного статуса у пациентов является программа внешней оценки качества. Без внешнего контроля сложно поддерживать единообразие лабораторных исследований, необходимое для адекватного мониторинга пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Результаты внешней оценки качества должны регистрироваться в лаборатории. В случаях, когда контрольные критерии не достигнуты должны приниматься меры для их устранения.

9. Постаналитические процедуры

Результаты иммунологических исследований должны регистрироваться соответственно СОПам, разработанным в лаборатории.

Результаты выдаются на разработанных в лаборатории бланках и должны содержать относительное и абсолютное количество исследуемых популяций клеток.

Должен быть разработан способ передачи результатов, если пробы поступают из других лечебных учреждений.

Все полученные результаты должны храниться длительное время и быть доступными для быстрого повторного воспроизведения.

В случае получения некорректного результата необходимо произвести повторное окрашивание и исследование на цитофлуориметре. Проверить параметры прибора, повторно исследовать окрашенный образец стабилизированной крови.

Все результаты лабораторного исследования должны быть сопоставлены с клинической картиной заболевания пациента на момент обследования.

В лаборатории должно быть установлено время выполнения каждой процедуры в зависимости от потребностей и в соответствии с существующими нормативными документами.

10. Ведение документации

В каждой лаборатории, занимающейся исследованием крови пациентов на проточных цитофлуориметрах должны быть сформулированы требования к ведению нормативно-технической документации.

Персоналом лаборатории осуществляется ведение документации по проводимым исследованиям, которая включает входящие документы — направления на исследование от врачей (первичные и повторные) и исходящие документы — отчеты с результатами проведенного исследования или возврат образца крови при его отбраковке. В лаборатории должна быть база данных, содержащая сведения об обследуемых пациентах и полученных результатах проводимых им исследований. Для каждого прибора должен вестись журнал, в который записываются сведения о ежедневной работе прибора, выявленных неисправностях и их устранении, проведении технического обслуживания, ежедневной и ежемесячной промывки прибора.

Помимо регистрации поступающих образцов крови, полученных результатов, следует также регистрировать проведение процедур внутрилабораторного контроля качества с использованием контрольных материалов.

В случае неудовлетворительных результатов при исследовании контрольных образцов или калибровочной кривой для приборов необходимо сделать соответствующую запись о результатах и коррекционных мерах, а после повторного приготовления пробы и анализа, вновь зарегистрировать полученный результат.

В случае поломки проточного цитофлуориметра, рекомендуется регистрировать дату и время данного происшествия, а также дату и время вызова инженера.

Также следует записывать данные обо всех применяемых реагентах и материалах: дата поступления, компания-поставщик, наименование продукта, каталожный номер, номер лота, срок годности, дата открытия. В лаборатории должны иметься инструкции фирм производителей по всем реагентам, методикам и оборудованию, которое используется в работе и утверждено соответствующими СОПами. Случаи возникновения аварийных ситуаций регистрируются в специальных журналах. Контроль над ведением документации осуществляется ответственным лицом в соответствии с действующими нормативами. В случае принятия новых нормативов необходимо отразить все изменения в соответствующем журнале.

11. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови при мониторинге ВИЧ-инфекции с использованием приборов, специально разработанных для ВИЧ-инфицированных пациентов

Существуют приборы, разработанные для лабораторий с небольшим количеством проводимых исследований (до 60 в день) и необходимостью обследования в труднодоступных районах и непосредственно у пастели больного.

11.1. Определение содержания субпопуляций лимфоцитов на проточном цитофлуориметре BD FACSCount

Проточный цитофлуориметр BD FACSCount специально разработан компанией Becton Dickinson (USA) для подсчета абсолютного количества субпопуляций лимфоцитов в цельной крови (без лизиса) у больных ВИЧ-инфекцией, как у взрослых, так и у детей. BD FACSCount — комплексная система, включающая прибор, реагенты, контроли и программное обеспечение. В ней использован прямой двухцветный метод для определения абсолютного и относительного количества субпопуляций лимфоцитов. Система позволяет осуществлять мониторинг иммунного статуса у  ВИЧ-инфицированных пациентов и мониторинг эффективности, проводимой антиретровирусной терапии (рис. 18).

3.1.5. Профилактика инфекционных болезней. ВИЧ-инфекцияРис. 18. Система BD FACSCount

Особенности системы BD FACSCount:

полностью автоматическая (закрытая) система — нет вмешательства оператора, нет возможности работать с использованием реагентов других производителей;простота протокола постановки контрольных проб с использованием нормальных образцов крови и набора контролей (BD FACSCount Control Kit) и реагентов (FACSCount CD4 Reagent и FACSCount Reagent Kit);требует проводить контроль качества ежедневно перед работой на приборе или всякий раз, когда используется новый набор реагентов;внутренняя или операционная проверка достоверности контроля качества, которая позволяет подтвердить правильность пробоподготовки и настройки оборудования.

Прибор работает в условиях стандартного электрического напряжения. Габариты: ширина 43, 2 см, высота 38, 1 см, глубина 55, 9 см, вес 25, 9 кг с пустыми резервуарами для жидкостей. Есть инструкции по инсталляции и эксплуатации на русском языке.

Система BD FACSCount состоит из следующих компонентов:

прибор BD FACSCount и системное программное обеспечение;тестовые реагенты для прибора;фиксирующий раствор (5% формальдегид);растворы контрольных частиц (четыре уровня — нулевой, низкий, средний и высокий);автоматическая пипетка BD FACSCount, запрограммированная на процедуру обратного дозирования объема 50 мкл.

Для работы системы BD FACSCount необходимо иметь дискету с программным обеспечением для подсчета абсолютного количества CD4-, CD8- и CD3-лимфоцитов (для взрослых) и (или) дискету с программным обеспечением для подсчета относительного и абсолютного содержания CD4-лимфоцитов (для детей).

Реагенты для системы BD FACSCount:

набор контрольных материалов (BD FACSCount Control Kit) — полистирольные частицы в четырех различных концентрациях;FACSCount Reagent Kit (двухцветный реагент на основе моноклональных антител CD3/CD4 и CD3/CD8) — пробирки с референтными флуоресцентными частицами для абсолютного счета;FACSCount CD4 Reagent (реагент для подсчета относительного количества CD4-лимфоцитов) — пробирки с референтными флуоресцентными частицами для абсолютного счета;контроли BD FACSCount;контрольный комплект BD FACSCount состоит из парных наборов контрольных частиц, содержащих флуоресцентные полистирольные шарики (2 мкм) в четырех концентрациях (нулевой, низкой [50 частиц/мкл], средней [250 частиц/мкл] и высокой [1000 частиц/мкл]).

Программное обеспечение прибора включает программу контроля качества, при помощи которой оценивается линейность. Для настройки системы производитель предлагает набор контрольных материалов (BD FACSCount Control Kit), содержащий частицы в четырех концентрациях (нулевая, низкая, средняя и высокая), которые необходимо добавить к образцу донорской крови. Контрольное исследование необходимо проводить ежедневно перед началом работы и всякий раз, когда открывается новый набор реагентов.

Система BD FACSCount дает возможность участвовать во внешнем контроле качества, используя контрольные материалы на основе стабилизированных препаратов крови. Прибор протестирован в лаборатории ФНМЦ ПБ СПИД в присутствии представителя фирмы — производителя прибора Tiffany Clarke (Becton Dickinson, USA) в январе 2008 г.:

успешно прошел испытания с контрольным материалом стабилизированной крови ImmunoТrol, Beckman Coulter, USA;при использовании прибора получены удовлетворительные данные в системе внешней оценки качества;на приборе успешно пройден международный внешний контроль качества QASI, Канада (Quality Assessment and Standardization for Immunological Measures relevant to HIV/AIDS — международная программа внешнего контроля качества, рассчитанная на лаборатории, осуществляющие мониторинг числа CD4-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов).

Процедура подготовки образцов, включает добавление в пробирку с реагентами цельной крови, инкубацию и последующее добавление фиксирующего вещества. Программа идентифицирует популяцию Т-лимфоцитов и оценивает группы клеток и частиц с помощью эллиптических орбитальных регионов. Для обеспечения статистически значимых результатов, собирается необходимое число клеток (до 30 тыс.).

Подготовка образцов с помощью FACSCount Reagent Kit занимает два часа. Допустимый срок хранения крови (строго при температуре 18–25 °С) 48 часов. Допустимый срок анализа готовых образцов при использовании FACSCount Reagent Kit после фиксации от 2 до 48 часов (готовые образцы хранятся в обычном холодильнике при 4 °С).

Подготовка образцов с помощью FACSCount CD4 Reagent занимает один час за счет сокращения времени инкубации. Допустимый срок хранения крови (строго при температуре 18–25 °С) не более 24 часов. Допустимый срок анализа готовых образцов при использовании FACSCount CD4 Reagent после фиксации от 2 до 48 часов (готовые образцы хранятся в обычном холодильнике при 4 °С).

Система BD FACSCount сообщает данные, если они находятся в пределах диапазонов: CD4 — 1–2000 клеток/мкл, CD8 — 1–2000 клеток/мкл, CD3 — 1–3500 клеток/мкл. Система BD FACSCount производит автоматический вывод на печать результатов исследования контролей и образцов по окончании процесса анализа. Результаты контроля («Pass» или «Fail», «прошел» или «не прошел») сообщаются для каждого образца.

Отчет по анализу образцов, приготовленных с использованием FACSCount Reagent Kit, содержит сведения об абсолютном количестве CD4 и CD8 Т-лимфоцитов в 1 микролитре крови (кл/мкл), индекс соотношения CD4 /CD8, среднее число CD3 Т-лимфоцитов, определенное по данным двух пробирок, и результаты последнего контроля.

Отчет по анализу образцов, приготовленных с использованием FACSCount CD4 Reagent, содержит сведения об абсолютном и относительном количестве CD4-лимфоцитов в 1 микролитре крови (кл/мкл) и сведения о последнем проведенном контроле.

(Продолжение следует)


1Проект. МР разработаны СНИО ЭП СПИД ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора ( Л. В. Серебровская, О. Н. Хохлова, Л. А. Иванова, Н. В. Герасимова). Утверждены ученым советом ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора 18 ноября 2014 года. Продолжение. Начало см.: Справочник заведующего КДЛ. 2015. № 2. С. 45–78, № 3, С. 64–77. >> вернуться в статью2 Через точку с запятой указаны обозначения, используемые Becton Dickinson и Beckman Coulter соответственно. >> вернуться в статью3 Через точку с запятой указаны обозначения, используемые Becton Dickinson и Beckman Coulter соответственно. >> вернуться в статью



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Новые документы

Закупки по 44-ФЗ
Квалификация
Платные услуги
Популярное у экономистов медучреждений
Популярное у главных медсестер

Мероприятия





Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×