Масс-спектрометрии в идентификации микроорганизмов

350

Для микробиологов исследовательских лабораторий актуальной проблемой остается идентификация разных микроорганизмов, что связано с длительным периодом инкубации после посева культур. Для некоторых плесневых грибов и микобактерий он может составить несколько недель.

Поэтому информация р микробных возбудителях при использовании классических методов исследования поступает к лечащим врачам слишком поздно.

Метод масс-спектрометрии является современным диагностическим методом, который не только позволяет существенно сократить сроки исследования, но и неоднократно подтверждает свою точность.

Методы изучения белков

Основными методами изучения микробных белков на данный момент являются:

  • высокоскоростное центрифугирование;
  • ионная хроматография;
  • электрофорез.

Однако, лишь у научно-исследовательских лабораторий есть возможность применения таких сложных методов исследования. Например, электрофорез применим лишь для небольших серий исследований, поскольку методика является трудоемкой и нестандартизированной.

Принципиально новый подход – оценка разнообразия пептидов и белков в микроорганизме, применительно к которому появилось понятие «протеом», т.е. совокупность белковых частиц в исследуемом образце.

Для анализа протеом необходимо проводить полную статистическую обработку всего массива белковых молекул в биоматериале.

Масс-спектрометрия белков

Методика масс-спектрометрии известна научному сообществу уже более века, однако не так давно она стала достаточно точной и удобной для того, чтобы применяться в биомедицинских исследованиях. Распространение масс-спектрометрии связано и с созданием специального программного обеспечения для автоматизации некоторых процессов.

Именно масс-спектрометрия является на сегодня наиболее точным физическим методом анализа биомолекул.

Современное устройство по спектрометрии состоит из трех взаимосвязанных блоков:

  • источник ионов, в котором происходит ионизация анализируемых молекул вещества и их последующее испарению в газовую среду;
  • анализатор масс. В газовом потоке ионы разделяются по заряду или массе;
  • детектор частиц. Молекулы после газовой среды летят к детектору, где они и регистрируются.

После прохождения этих этапов  в электронную базу собираются все данные о числе и соотношении ионов в материале. После этого они сравниваются с белковыми профилями, которые находятся в памяти программы.

Этот частный метод масс-спектрометрии и ионизации белковых соединений получил название MALDI-TOF. Именно мягкий режим ионизации сохраняет молекулы от возможного повреждения и одновременно заряжает их.

Для того, чтобы процесс прошел правильно, предназначенный для анализа материал необходимо смешать с раствором для образования «матрицы» ионизации.

После этого, действующий в течение нескольких наносекунд лазерный луч, вызывает испарение и ионизацию заряженных частиц. Далее они разгоняются в постоянном электрическом поле с разными скоростями и мигрируют к детектору.

Основным измеряемым параметром при этом является скорость молекулы, которая определяется соотношением ее заряда и массы.

После подсчета числа молекул можно сформировать характеристический спектр, отражающий набор фрагментов белка в данном микроорганизме. Такой спектр позволяет узнать соотношение микробных рибосомных белков, которые составляют 70% массы микроба.

Поэтому рассматриваемая методика и другие родственные методы  щадящей ионизации пользуются особой популярностью среди микробиологов и других специалистов.

На рисунке ниже схематично изображен процесс ионизации.

Масс-спектрометрии в идентификации микроорганизмов

Преимуществом системы MALDI-TOF является и мощная техническая поддержка – электронная база позволяет хранить и накапливать информацию, которая поступает с детектора. Кроме того, система позволяет производить статистическую оценку информации и сопоставление ранее полученных и зарегистрированных результатов.

Таким образом, суть методов, основанных на масс-спектрометрии, заключается в проведении оценки соотношения заряда и массы конкретных молекул в биологическом образце.

Самые первые методики масс-спектрометрии  еще допускали деградацию образцов и жесткую обработку, поэтому подходили в основном для выявления малых молекул, например, сахаров, молекул лекарств, жирных кислот и т.д.

Новые же технологии мягкой ионизации, к которым относится MALDI, позволяет анализировать достаточно крупные молекулы, например, белки. При этом применительно к исследованию белков, методика позволяет определить спектр белковой молекулы, которая так же уникальна, как и отпечатки пальцев.

Далее мы рассмотрим возможности использования масс-спектрометрии в практической деятельности врачей-микробиологов.

Видовая идентификация микробов

Изначально клинический метод масс-спектрометрии был создан для видовой идентификации микроорганизмов.

Для того, чтобы исследование прошло успешно, достаточно лишь одной колонии микробов. Полученный в ходе анализа белковый спектр в образце чистой культуры необходимо сравнить с имеющимися в базе данных профилями, которые обычно предоставляет производитель.

Такой метод масс-спектрометрии позволяет с вероятностью в 99% провести типирование клинического изолята.

Возможности метода ограничены лишь возможностями программного обеспечения.

Например, микроорганизм будет идентифицирован верно, если в базе данных содержится полная информация о вариабельности некоторых генов, например rpoB. Также база данных должна содержать полные сведения о микроорганизмах, которые характерны для конкретного региона в силу географических особенностей. От этого зависит фенотип и генотип местной микрофлоры.

Диагностика сепсиса

Метод масс-спектрометрии помогает проводить поиск маркеров микробов в крови человека при сепсисе.

Новейшие исследования посвящены методическим вопросам и аналитическим свойствам метода при исследовании гемокультур микробов, которые являются сложным для исследования материалом.

Если инкубация гемокультуры приведет к микробном росту, то эти образцы в дальнейшем будут направлены на микроскопию и пересев для проведения классических процедур инкубации.

Новые же методы позволяют проводить быструю экстракцию микробных белков с тем, чтобы провести идентификацию  микроба MALDI-TOF. При этом не требуется проводить дополнительный посев на агаре.

Одной из проблем протеомного анализа является отсутствие  стандартной процедуры экстракции белков из сложных образцов, которая позволяет качественно очистить бактериальные белки от избытка балластных белков крови.

Решение этой проблемы предлагают наборы Sepsityper Kit, которые позволяют экстрагировать разные микробные патогены из крови. Однако, грамположительные микробы выявляются не столь эффективно.

Поэтому на данный момент нерешенной остается проблема количественной экстракции микробных белков для проведения масс-спектрометрического исследования.

Основные ограничения и недостатки масс-спектрометрии

Часто производители MALDI-TOF используют прямой анализ профиля белковых соединений. С этой целью единичная колония микроба должна быть перенесена на подложку и покрыта матриксным раствором.

Методом легкого профилирования легко определяются такие грамотрицательные микроорганизмы, как Neisseria spp., Yersinia spp и др.

Но выявление грамположительных кокков требует дополнительной обработки.

Поэт ому главным условием качественного и точного проведения исследования для выявления микроорганизмов является правильная подготовка образца материала.

Конечный результат зависим от химического состава клеточной стенки микроорганизм а, а также от источника клинического изолята.

Также, в ходе исследований определено, что грамположительные бактерии должны быть подвержены специальным методам экстракции белков. При исследовании же отрицательных бактерий специальной обработки не требуется.

Кроме описанных выше способов применения масс спектрометрии в клинической лабораторной практике, метод интересен и для других сфер практической медицины:

  • проведение научных исследований;
  • создание новых лекарственных препаратов. С помощью изучения профилей штаммов, которые устойчивы к лекарствам, можно находить новые точки фармакологического воздействия;
  • классификация штаммов из разных изолятов;
  • диагностирование инфекционных заболеваний человека и животных;
  • метод применим в пищевой промышленности – масс-спектрометрия позволяет анализировать присутствие неблагоприятных микроорганизмов на ранних этапах производственного процесса.

Итак, внедрение методов масс-спектрометрии значительно ускоряет работу исследователей по идентификации разных микроорганизмов. Для анализа требуется всего лишь одна единичная колония микроорганизмов и сравнительно небольшой объем биологического материала.

Однако, несмотря на простоту этого метода, все еще актуальна необходимость новых исследований, которые позволят оптимизировать некоторые этапы исследования: преаналитическую обработку образцов, взятие проб нативного материала и т.д.

Все процедуры должны быть стандартизированы в зависимости от вида выявляемого микроорганизма.

Например, для анализа образцов гемокультур микробов, требуется применение специальных методов экстракции белковых соединений.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль