Определение тестостерона в крови

35

Определение тестостерона в крови играет значимую роль в клинической оценке многих эндокринных заболеваний.

  • При обследовании мужчин исследование уровня тестостерона способствует выявлению гипогонадизма различной этиологии, преждевременного полового развития или отставания физического развития у мальчиков, обеспечивает мониторинг адекватности гормональной заместительной терапии андрогенами.
  • Чрезвычайно важен мониторинг содержания тестостерона в крови у пациентов с раком простаты, получающих гормональную терапию.
  • Одновременное определение тестостерона, лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона способствует получению информации о природе гормональной дисфункции семенников. В частности, определение концентрации тестостерона как объективного маркера необходимо для подтверждения возрастного дефицита гормона при назначении гормональной терапии.
  • У женщин определение уровня тестостерона в крови необходимо для оценки функции гонад при гирсутизме, алопеции, акне, подозрении на андрогенсекретирующие опухоли яичников и надпочечников, при мониторинге лечения гирсутизма для выбора оптимальной дозы препарата, подавляющего избыточную продукцию андрогенов [1].

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения тестостерона в крови

В лабораторной практике в настоящее время для определения концентрации тестостерона, как и других гормонов, широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Метод ИФА появился в лабораторной практике в середине 1960-х гг. в результате бурного прогресса биотехнологии, иммунологии и др. наук. В 1980-е гг. XX века технология ИФА заняла ведущее место в лабораторной диагностике специфических заболеваний.

Развитие научно-технического прогресса способствовало совершенствованию методов иммуноанализа, около 25 лет назад появились методы иммуноанализа 3-го поколения (иммунохемилюминесцентный анализ) с использованием европия в качестве метки антител.

Технология иммуноанализа с использованием европия была предложена группой финских ученых (система «Дельфия») и быстро завоевала большую популярность.

В это же время английскими учеными разрабатывался метод усиленной хемилюминесценции (ИХА), основанный на применении ферментов для усиления сигнала реакции и субстратов люминофоров, с регистрацией сигнала при использовании автоматических анализаторов закрытого типа.

Читайте в свежем номере журнала «Справочник заведующего КДЛ»:

  • Учет медицинских услуг в информационной системе ОМС: проблемы и типичные ошибки
  • Обучение сотрудников медицинской организации за счет работодателя
  • 15 октября 2016 года прошло награждение лауреатов XVI Всероссийского конкурса профессионального мастерства«Лучший врач года»
  • Приказом Высшей аттестационной комиссии от 18.11.2016 № 1474/нк
  • Эффективный контроль гликемии вне лаборатории: требования стандартизации для безопасности пациента

Оформить подписку   только до 31 января 3 месяца в подарок!

Методы иммуноанализа 3-го поколения характеризуются более высокой чувствительностью и позволяют определять низкие концентрации тестостерона (1 × 1013М) равно как и других гормонов [1, 2].

В настоящее время методы ИХА, вошедшие в практику лабораторной диагностики в результате автоматизации лабораторных исследований, доминируют в эндокринологических и клинических биохимических лабораториях всего мира, заменив методы радиоиммунного анализа (РИА), использовавшиеся в качестве эталонных методов в середине прошлого века.

Многочисленные исследования по сопоставимости результатов, полученных методами ИХА и РИА, показывают, что данные ИХА сопоставимы с РИА, а по отдельным характеристикам метод ИХА превосходит РИА [2].

Автоматизированные системы закрытого типа минимизируют влияние человеческого фактора на результат исследования.

Основные преимущества автоматизированных систем:

  • высокая производительность,
  • безопасность персонала,
  • стандартизация аналитического этапа исследований,
  • оперативность в выдаче результатов пациенту и экономическая выгода [3].

В последнее время в практику лабораторных исследований стали внедряться методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, основанные на разделении биологического материала на фракции и выделении нужных аналитов [15].

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ,UPLC или LC) является одним из самых точных методов аналитической химии. ВЭЖХ позволяет качественно и количественно определить практически все встречающиеся в живом организме соединения: от низкомолекулярных (витамины, сахара, аминокислоты, нуклеотиды, пептиды и т. д.) до высокомолекулярных биологически активных полимеров (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, и др.). ВЭЖХ применяется:

  1. для проведения терапевтического лекарственного мониторинга и фармакокинетических исследований с целью определения индивидуальной схемы дозировки препаратов и контроля качества лечебных и реабилитационных процедур;
  2. для диагностики ряда заболеваний (определение различных метаболитов в биологических образцах);
  3. для контроля качества биологически активных добавок к продуктам питания;для контроля качества лекарственных средств.

Однако активное применение ВЭЖХ в повседневной рутиной практике лабораторной службы ограничено следующими причинами:

  1. дорогостоящая аппаратура и расходные материалы (колонки, элюенты);
  2. отсутствие стандартизированного протокола исследований и необходимость привлечения квалифицированных специалистов химического анализа.

Масс-спектрометрия при определении тестостерона в крови

Одним из методов современного анализа биологического образца является масс-спектрометрия.

Масс-спектрометрия (MS) – физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду.

Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать белки, оценить, какие изменения произошли с их структурой вследствие различных взаимодействий, определить пути метаболизма различных лекарственных средств и других соединений и идентифицировать метаболиты (например, исследование мочи диабетического больного, рис. 2).

Масс-спектрометрия – единственный метод, решающий все эти и многие другие задачи аналитической биохимии [5]. В научных журналах уже появилось незначительное количество публикаций в области исследования стероидных гормонов методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (UPLC/MS или LC/MS) [9, 11, 12, 17].

В отдельных публикациях авторы предлагают использовать метод LC/MS как «золотой стандарт» диагностики в медицинских лабораториях при рутинном определении тестостерона у пациентов, считая, что метод обладает большей чувствительностью при низких концентрациях, на его результаты не влияет возможная интерференция других стероидов и лекарственных средств [6, 13].

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 1. Хроматограмма стандартных растворов стероидных гормонов

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 2. Хроматограмма мочи диабетического больного

Основными этапами метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) являются:

Предварительная подготовка биоматериала: экстракция из биоматериала и выделение требуемого аналита. Процедура требует затрат на реагенты; соответствующего лабораторного оборудования, соблюдения четкого регламента всех стадий и достаточно высокой квалификации химика-аналитика. Процедура трудоемкая, достаточно длительная по времени.

Жидкостная хроматография. Использование жидкостной хроматографии подразумевает несколько этапов работы: подготовка хроматографического оборудования к работе и обязательная калибровка оборудования стандартными растворами гормонов (рис. 1); оценка и анализ хроматограмм с интерпретацией пиков распределения стандартов (рис. 2) – работа, требующая высокой квалификации химика-аналитика [5].

Масс-спектрометрия. Для получения спектров можно использовать как один, так и два последовательно соединенных масс-спектрометра. Анализ и интерпретация масс-спектрограмм белков осуществляются с использованием каталога или библиотеки.

На сегодняшний день масс-спектрометрия, в частности технология MALDI-TOF нашла широкое применение в области клинической микробиологии при идентификации микроорганизмов.

Метод хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией нашел свое место и в качестве новой медицинской технологии в оценке микроэкологического статуса человека [5]. Метод проходил апробацию в медицинских учреждениях г. Москвы в течение пятнадцати лет, и только в 2010 г. Росздравнадзором было дано разрешение на его применение в лабораторной диагностике.

Для работы на масс-спектрометре требуется квалифицированный специалист с опытом работы. К тому же, профили масс-спектрограмм тестостерона [7, 16] демонстрируют неоднозначность вопроса определения уровня тестостерона методом LC/MS (рис. 3).

В зависимости от концентрации тестостерона в биологическом материале будет отмечаться на спектрограмме четкость или размытость профиля, количество, характер пиков и их расположение будет неодинаковым, что создает определенные трудности при интерпретации результатов исследования при масс-спектрометрии.

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 3. Спектр тестостерона с концентрацией в сыворотке крови 0,006 нмоль/л (1,7 нг/дл)

В отдельных публикациях, авторы отмечают что «Наиболее выраженная систематическая ошибка наблюдается при определении низких концентраций тестостерона, то есть у тех пациентов, у которых при клиническом обследовании заподозрено наличие дефицита андрогенов» при сопоставлении результатов определения тестостерона разными методами [6, 7, 13]

В 2009 г. за рубежом было проведено исследование по сравнению методик технологии LC/MS, используемых в отдельных лабораториях (табл. 1), результаты которого показывают различие в функциональной чувствительности и высокий коэффициент вариации при низких концентрациях тестостерона [7, 16].

Таблица 1. Сравнение методик высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией

Параметры Y. Chen et al [15] Kushnir et al [8] Turpeinen et al [12]
Вид масс-спектрометрии LC/MS* LC/MS LC/MS
Стадия экстракции + + +
Объем образца, (mL) 0,25 0,1 0,25–0,5
Время выполнения исследования одного образца (min)* 6,5 3 10
Функциональная чувствительность, (nM) 0,056 0,035 0,15
Коэффициент вариации (CV) в пределах одного тестирования, % 4,5 при 1,3нМ 2,4 при 11нМ 1,9 при 3,4нМ 6,2 при 4,2нМ 2,3 при 7,2нМ 3,1 при 2нМ 0,9 при 20нМ

* LC/MS - жидкостная хроматография с масс-спектрометрией.

Ниже представлены данные (табл. 2) сравнения рабочих диапазонов определения тестостерона при использовании хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией [8].

Таблица 2  Рабочие диапазоны определения тестостерона в крови методом хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией

Лаборатории Принцип измерения Рабочий диапазон, (нг/дл)
Endocrine and metabolic research laboratory at Los Angeles biomedical research institute LC/ MS* 2,0–2000
LabCorp LC/ MS* 2,5–5000
Brigham research assay core (BRAC) laboratory at harvard medical school LC/ MS* 1,0–2000
Covance central laboratories servicel, Inc. LC/ MS* 2,0–8000
ARUP laboratories, Inc. LC/ MS* 1,0–2500
Clinical chemistry sahlgrenska university hospital Gothernbrug, Sweden GC/ MS** 2,5–1000
ZRT laboratory LC/ MS* 10–1000
Pathology associates medical laboratories, LLC LC/ MS* 3,5–1000

LC/ MS* – жидкостная хроматография с масс-спектрометрией.GC/ MS** – газовая хроматография с масс-спектрометрией.

Сравнение результатов применения методов LC/MS и существующих иммунологических методов для определения тестостерона, проведенное на образцах крови 30 женщин и 32 мужчин [7] выявило их корреляцию (рис. 4).

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 4. Корреляция результатов определения концентрации тестостерона, полученных иммунологическим методом и LC/MS

Основные проблемы применения метода LC/MS для определения тестостерона в крови пациентов, заключаются в следующем:

  1. Метод LC/MS не валидирован: существует множество вариантов подготовки образцов для выделения тестостерона из сыворотки крови; условий проведения LC и снятия масс-спектров. Отсутствуют стандарты и единые референсные диапазоны.
  2. Все этапы подготовки образцов – ручные процедуры, что не исключает возникновение ошибок на любой стадии выделения тестостерона из биологического материала. Наличие дополнительных ручных процедур увеличивает время исследования образца и выдачи результата пациенту: пропускная способность исследований для определения концентрации тестостерона методом LC/MS составляет 11 образцов/ч [4].
  3. Жидкостной хроматограф и масс-спектрометр, так же как и любые другие анализаторы, требуют выполнения калибровок. Калибровка хроматографа при получении спектра тестостерона осуществляется по нескольким стандартам, что приводит к удорожанию исследования.
  4. Для проведения исследований по определению концентрации тестостерона методом LC/MS КДЛ должны будут ввести в штат лаборатории дополнительного сотрудника с высшим профильным образованием в области аналитической химии и молекулярной биологии.
  5. По информации на начало 2007 г., только 0,5% медицинских лабораторий за рубежом начали применять метод LC/MS для рутинных исследований концентрации стероидных гормонов, в том числе и тестостерона [8].


Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль