Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислот

1865

Лабораторные исследования для выявления ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ-тест) высокого канцерогенного риска в настоящее время все чаще применяются в программах цервикального скрининга во многих странах, в т. ч. и в России.

Главная цель ВПЧ-теста как метода скрининга – не пропустить пациенток с наличием ВПЧ-инфекции, которая ассоциирована с цервикальной интраэпителиальной неоплазией высокой степени тяжести (ЦИН 2+). Важнейшей задачей скрининга также является отсев лиц, у которых развитие тяжелой неоплазии маловероятно, в т. ч. и среди носителей ВПЧ определенных генотипов. Алгоритмы использования ВПЧ-теста в программах скрининга подробно описаны авторами ранее [1, 2].

В 2009 г. группой международных экспертов были сформулированы четкие требования к диагностическим и аналитическим характеристикам ВПЧ-тестов, предназначенных для первичного скрининга [4]. Диагностические характеристики ВПЧ-тестов должны быть определены при использовании образцов, валидированных гистологическими исследованиями, или в сравнении с результатами стандартного ВПЧ-теста, в качестве которого рекомендован набор реагентов c использованием метода гибридного захвата Hybrid Capture 2 HPV test (HC2), производитель – компания Digene (США):
• ВПЧ-тест должен демонстрировать клиническую чувствительность в выявлении ЦИН 2+ не ниже 90% на гистологически верифицированных образцах;
•клиническая специфичность ВПЧ-теста для ЦИН 2+ должна быть не ниже 98% относительно клинически валидированного ВПЧ-теста (HC2) для женщин старше 30 лет;
•воспроизводимость результатов тестирования в лаборатории (intralaboratoryassay) и между лабораториями (inter-laboratory assay) не должна быть меньше 87%.

Для обеспечения высокой аналитической чувствительности и специфичности ВПЧ-теста группа международных экспертов установила правила разработки и валидации новых тестов. Общепринятым международным стандартом, который необходимо использовать для валидации вновь разработанных ВПЧ-тестов, является Hybrid Capture 2 HPV test:
• ВПЧ-тесты должны выявлять широкий спектр генотипов ВПЧ, относящихся к категории высокого канцерогенного риска;
•оптимальной является возможность выявления 13 типов ВПЧ высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68);
• ВПЧ-тесты должны выявлять клинически значимую (релевантную)концентрацию вируса, которая составляет 1 пикограмм (105 копий)ДНК ВПЧ в 1 мл.

В настоящее время российскими производителями выпускается большое количество наборов для выявления ДНК ВПЧ методами амплификации нуклеиновых кислот. Большинство из них зарегистрированы и разрешены к применению в Российской Федерации, однако не все наборы реагентов удовлетворяют требованиям, предъявляемым к ВПЧ-тестам для скрининга [2, 3].

В соответствии с упомянутыми рекомендациями группы международных экспертов [4] для испытаний и валидации вновь разработанных ВПЧ-тестов в обязательном порядке должен использоваться общепринятый международный стандарт Hybrid Capture 2 High Risk HPV test, который разрешен для применения в России, но из-за высокой стоимости оборудования и реагентов не всегда доступен российским производителям и лабораториям, использующим ВПЧ-тесты. Другим способом валидации новых наборов реагентов является использование стандартных контрольных образцов, содержащих аналит (ДНК ВПЧ) в нужной концентрации и с заданными параметрами. Панели контрольных образцов, широко используемые в международных системах внешней оценки качества лабораторных исследований (QCMD, VQC и др.) для выявления ДНК и РНК различных микроорганизмов (HIV, HBV, HCV, CMV, EBV и т. д.), для контроля качества ВПЧ-тестов пока не предлагаются.

Значимость лабораторных исследований для обеспечения такой социально важной задачи, как скрининг для выявления ВПЧ высокого канцерогенного риска, явилась основанием для принятия ФГУН “Центральный НИИ эпидемиологии” Роспотребнадзора решения о разработке панели образцов, содержащих ДНК ВПЧ различных типов в клинически значимых концентрациях, которые могут быть использованы как для внутреннего, так и для внешнего контроля качества лабораторных исследований по выявлению ДНК ВПЧ.Для приготовления контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ и ДНК человека, использовали плазмиды, очищенные из E. coli, содержащие практически полный геном ВПЧ 16-го, 18-го, 31-го, 45-го и 11-го типов (за исключением участков, не используемых в качестве мишени в ВПЧ-тестах). После обработки рестриктазами материал разводили в буфере для хранения ДНК (ТЕ-буфер, содержащий ДНК спермы лосося в конечной концентрации 0,01 мг/мл). Концентрацию рекомбинантных ДНК измеряли с помощью тест-системы CQS-Bla-System (табл. 1), используя в качестве мишени ген β-лактамазы, который содержит плазмидный вектор, применяемый для клонирования генома ВПЧ. При приготовлении проб с заданной концентрацией для разведения использовали смесь буфера для хранения ДНК и транспортной среды с муколитиком (“ТСМ” производства ФГУН “Центральный НИИ эпидемиологии” Роспотребнадзора) в соотношении 1 : 1. Такое соотношение обеспечивает длительное хранение образцов ДНК и полное нивелирование эффекта ингибирования полимеразной цепной реакции (ПЦР)при разведении в 10 раз.

Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислот

Для получения готовых образцов панели концентрированные растворы, содержащие рекомбинантные ДНК ВПЧ 16-го, 18-го, 31-го, 45-го и 11-готипов, разводили до концентрации 2 . 106 копий/мл. Такая концентрация ДНК ВПЧ необходима для возможности разведения контрольных образцов в транспортных средах разных производителей в 10 раз. В каждый образец добавляли ДНК плаценты человека до концентрации 0,04 мг/мл для стабилизации плазмидной ДНК и как аналог клеточной ДНК, которая содержится в реальном клиническом материале. Большинство современных ВПЧ-тестов, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, обладают способностью выявлять наряду с ДНК ВПЧ и ДНК генома человека, что необходимо для реализации принципа эндогенного внутреннего контроля, позволяющего контролировать качество не только аналитического, но и преаналитического этапа анализа (адекватность взятия клинического материала).Для изучения стабильности панели аликвоты образцов, содержащиеВПЧ 16-го и 18-го типов, помещали в термостаты при 4, 20, 30, 40, 56 °С. Тестирование образцов проводили еженедельно в течение 14 недель, затем раз в две недели в течение года. Для тестирования использовали набор реагентов “АмплиСенс® ВПЧ 16, 18-FL”, который позволяет определять концентрацию ДНК ВПЧ 16-го и 18-го типов и ДНК человека. Перед тестированием каждый образец разводили в соотношении 1 : 10. Каждый образец измеряли не менее четырех раз (табл. 2).

Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислот

Концентрация ДНК ВПЧ и ДНК человека снижалась более чем на 50%при хранении образцов в термостате при 56 °С – через 6 недель, при 40 °С –через 27 недель. Концентрация ДНК ВПЧ и ДНК человека не снижалась в течение года (51 неделя) хранения при температуре 30, 20 и 4 °С.Для изучения аналитических характеристик панели использовали тест-систему Hybrid Capture 2 High Risk HPV test (Quagen, США) и набор реагентов “АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL” (регистрационное удостоверение от 04.05.2008 № ФСР 2008/02567). Первая из них позволяет выявлять ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска 13 генотипов в концентрации не менее 105 копий ДНК ВПЧ в 1 мл, вторая – определять концентрацию ДНК ВПЧ и ДНК человека. Результаты представлены в табл. 3.

Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислотИспользование панели контрольных образцов в программе внешней оценки качества*. Создание панели контрольных образцов, содержащей ДНК ВПЧ разных генотипов, сделало возможным организацию нового раздела Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) – “ПЦР выявление вируса папилломы человека”. В 2010 г. лаборатории-участники для выполнения первого и второго циклов раздела получали наборы контрольных образцов, инструкции по их исследованию, бланки для представления полученных результатов, сведений об использованных в ходе работы методах, реактивах и оборудовании. Состав набора контрольных образцов, изготовленных во ФГУН “ЦНИИ эпидемиологии” Роспотребнадзора в соответствии с требованиями к их составу и свойствам, заданными экспертной группой ФСВОК, представлен в табл. 4.

Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислот

Участники получали оба набора одновременно, при этом в инструкции указывалось на необходимость исследования наборов с интервалом 3–4 месяца. В 2010 г. контрольные образцы были разосланы в 96 лабораторий.

Из 96 лабораторий, получивших наборы контрольных образцов, результаты исследований в первом цикле представили 95 лабораторий (99%), во втором цикле – 91 лаборатория (95%). В обоих циклах результаты представили 90 лабораторий (94%), только в первом цикле – 4 лаборатории, только во втором цикле – 1 лаборатория. Более двух третей участников раздела составляли три категории ЛПУ: 38% – коммерческие лаборатории, 25% – больницы и поликлиники, 16% – НИИ и вузы (рис. 1).

Первая российская панель для контроля качества выявления вируса папилломычеловека высокого канцерогенного риска методами амплификации нуклеиновых кислот

Все лаборатории-участники для тестирования панели контрольных образцов использовали реактивы отечественного производства, ни одна из российских лабораторий, использующих в рутинной практике HybridCapture 2 High Risk HPV test, в разделе ФСВОК “ПЦР-выявление вируса папилломы человека” не участвовала. ВПЧ-тесты, позволяющие детектировать широкий спектр типов ВПЧ высокого канцерогенного риска, использовали далеко не все участники, 28% лабораторий использовали тесты для выявления только ВПЧ 16-го и 18-го генотипов (рис. 2).

Следует отметить, что большинство лабораторий уже взяли на вооружение современные методы детекции продуктов амплификации. Так, 48%участников использовали методы амплификации в присутствии флуоресцентно меченных зондов с детекцией сигнала в режиме реального времени(RT-PCR), 31% – ПЦР с детекцией сигнала по конечной точке (end-point), и только 21% участников – ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Большинство лабораторий (76%) использовали для тестирования панели методы с оценкой результата в качественном формате. Только 24% лабораторий применяли количественные ВПЧ-тесты, которые позволяют дифференцировать клинически значимую концентрацию ВПЧ от незначимой, тем не менее и эти лаборатории представили результаты в качественном варианте. Полученные результаты исследования контрольных образцов лабораториями-участниками (табл. 4) позволяют отметить, что доля правильных результатов превышала 95% при выявлении практически всех генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска (16-го, 18-го, 31-го, 45-го), так же, как и для образцов, для которых правильными считали отрицательные результаты, в обоих циклах раздела.

Впервые в России разработана панель контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ, аналитические характеристики которой оценены с использованием общепринятого международного стандарта Hybrid Capture 2 HighRisk HPV test. Результаты испытаний хранения контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ в клинически значимой концентрации и ДНК человека, продемонстрировали неизменность концентрации аналита при температуре4–30 °С в течение длительного времени. Высокая доля правильных результатов, полученная лабораториями –участниками ФСВОК при выявлении представленных в панели ДНК ВПЧ разных генотипов, указывает на возможность ее применения для проведения внешнего и внутреннего контроля качества лабораторных исследований.Список использованной литературы

1. Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей. М.: Изд-во“МЕДпресс-информ”, 2008. 56 с.
2. Шипулина О.Ю. Алгоритмы диагностики вируса папилломы человека // Справочник заведующего КДЛ. 2010. № 1. С. 3–11.
3. Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Минкина Г.Н., Шипицина Е.В., Савичева А.М., Шипулин Г.А. Клиническая валидация количественного ВПЧ-теста “АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр FL” в соответствии с международными требованиями. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молекулярная диагностика – 2010”. Т. 3.
4. C. Meijer, J. Berkhof, P. Castle et al. Guidelines for human papillomavirusDNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 yearsand older // Int. J. Cancer: 124, 516–520 (2009).

* Авторы выражают глубокую благодарность генеральному директору НП “ЦВКК”проф. В.Н. Малахову за разрешение опубликовать результаты, полученные участниками раздела ФСВОК “ПЦР-выявление вируса папилломы человека” в 2010 г.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России


Опрос

Какой Курс повышения квалификации для главных медсестер (дистанционная форма - 72 часа ) будет вам полезен? Отметьте один или более вариантов

  • Технологии эффективного управления сестринским персоналом 52.38%
  • Обращение медицинских отходов 50%
  • Современные требования к обработке эндоскопов и инструментов к ним 25%
  • Организация и порядок вакцинопрофилактики: ответственность главной медсестры 30.95%
  • Инфекционная безопасность и профилактика внутрибольничных инфекций: ответственность главной медсестры 66.67%
  • Управление лечебно-диагностической деятельностью медицинской организации 29.76%
  • Экономическая и предпринимательская деятельность медицинской организации 16.67%
  • ДРУГОЕ 4.76%
Другие опросы


Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль