Флуоресцентная in situ гибридизация для определения амплификации гена HER2/neu на цитологическом материале

3100

В связи с развитием методов таргетной терапии для лечения онкологических больных становится необходимым определение молекулярных мишеней лекар­ственных препаратов в повседневной клинической практике.

Одним из таких препаратов является герцептин (транстузунаб), который представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное анти­тело, связывающееся с рецепторами HER2/neu на поверхности опухолевых клеток. Высокая эффективность герцептина обусловлена как прямой цито-токсичностью, так и непосредственным блокированием пролиферации, стиму­ляцией апоптоза, антиангиогенной активностью. HER2/neu относится к семей­ству тирозинкиназных рецепторов ERBB, которое состоит из четырех функционально взаимосвязанных рецепторных молекул, играющих важную роль в пролиферации, апоптозе и дифференцировке клеток. Это семейство включает в себя эпидермальный фактор роста ERBB1 (EGF), ERBB2 (HER2/neu), ERBB3, ERBB4. При гиперэкспрессии белка HER2/neu и/или амплификации гена его влияние может резко усиливаться. Гиперэкспрессия HER2/neu обнаружена в 20-30% случаев инвазивного протокового рака молочной железы (РМЖ), а в случаях неинвазивного рака эта величина достигает 90%. Состояние гена HER2/neu и уровень экспрессии белка HER2/neu необходимо определять для вы­яснения прогноза у больных инвазивным РМЖ и отбора пациентов с наличием гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu для лечения герцептином, т. к. только в этих условиях препарат эффективен.

Существует несколько методов выявления гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu: иммуноцитохимический (ИЦХ), гибриди­зация in situ (флуоресцентная и хромогенная), полимеразная цепная реакция -но на практике доминирует ИЦХ-метод определения HER2-статуса РМЖ [1]. При неопределенном ИЦХ HER2-статусе требуется проведение исследования, прямо выявляющего наличие или отсутствие амплификации, методом флуо­ресцентной in situ гибридизации (FISH).

Авторами были исследованы аспирационные тонкоигольные биоптаты 20 больных инвазивным протоковым РМЖ, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена. Клеточный материал (после пункции) помещали в специаль­ную питательную среду накопления, затем взвесь клеток распределяли по 50­100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin-3 (Shandon, Англия) и цен­трифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Полученные препараты использовали для исследований методом ИЦХ-реакции с антителами C-erbB-2(HER-2/neu) (Dako, Дания) и методом FISH с применением коммерческого на­бора HER2FISH (Dako, Дания).

Интенсивность ИЦХ-экспрессии антител C-erbB-2(HER2/neu) оценивали полуколичественно. Отрицательной ИЦХ-реакцией (0) считали отсутствие мембранного окрашивания или выявление его менее чем в 10% клеток. Окра­шивание слабой интенсивности мембран более чем 10% клеток опухоли оцени­вали как 1+. Неопределенной ИЦХ-реакцией (2+), требующей проведения ис­следования методом FISH, являлось умеренное мембранное окрашивание более 10% клеток опухоли. Положительной ИЦХ-реакцией (3+) считали резко выра­женное мембранное окрашивание более 10% клеток. Окрашивание цитоплазмы во внимание не принималось.

Для выполнения исследования методом FISH использовались флуорес­центные зонды HER2FISH (Dako). Цитологический материал, прочно зафик­сированный на высокоадгезивных предметных стеклах, обрабатывали пеп­сином, чтобы облегчить проникновение зонда к ядерной ДНК. Благодаря нагреванию происходила денатурация ДНК и последующая гибридизация одноцепочечной ДНК, комплементарной к внесенному зонду. Амплифика­цию оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении объектива 100х. Оценку наличия/отсутствия амплификации проводили пу­тем подсчета соотношения красных и зеленых меток (соответствующих по­меченным участкам гена HER2 и центромерного участка) в 20 ядрах. При со­отношении красных и зеленых меток, равном 2 и более, результат считали положительным.

В проведенном исследовании в 6 случаях иммуноцитохимически определили гиперэкспрессию антител c-erbB-2(HER2/neu) (3+), в 11 - получили результат, оцененный как 2+, требующий проведения исследования методом FISH, в 2 -ИЦХ-реакция была слабой интенсивности (1+), и в 1 случае экспрессия отсут­ствовала (0).

При проведении исследования методом FISH во всех случаях с ИЦХ-реакцией 3+ обнаружили амплификацию гена HER2/neu, в 3 случаях с отрица­тельной и слабоположительной ИЦХ-реакцией амплификация не выявлена.

В группе с ИЦХ-реакцией 2+ амплификация была обнаружена у 7 больных и в 4 случаях она отсутствовала.

Таким образом, была продемонстрирована возможность выполнения ис­следования методом FISH для определения амплификации гена HER2/neu на цитологических препаратах до начала какого-либо лечения и необходимость ее проведения при умеренно выраженной ИЦХ-экспрессии HER2/neu, что крайне важно для назначения таргетной терапии.

Н.Н.Волченко,
д-р мед. наук, руководитель отделения,

Е.Н. Славнова,
канд. мед. наук, ст. науч. сотр.
Отделение онкоцитологии ФГУ "МНИОИ им. П.А. Герцена"Росмедтехнологий, г. Москва



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль