Применение иммуноблота в диагностике сифилиса

8613
Применение иммуноблота в диагностике сифилиса

В настоящее время перед специалистами лабораторной службы стоят новые задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагности­ки и лечения инфекционных заболеваний, среди которых важное место зани­мает сифилис. Во многом их решение зависит от уровня информативности применяемых методов исследования и расширения диагностических возмож­ностей.

Внедрение в практику иммуноферментного анализа (ИФА) вместо реакции Вассермана значительно повысило качество лабораторной диагностики сифилиса. Существенным преимуществом данного метода является возможность авто­матизации процесса исследования, что позволяет снизить влияние человеческого фактора. Вместе с тем продолжается поиск методических подходов к диагностике раннего сифилиса, разработка новых панелей сыворотки с нормированным содержанием диагностически значимых белков Treponema pallidum и внедре­ние в практику подтверждающих тестов.

Однако по-прежнему положительные серологические реакции на сифилис, в т. ч. на серорезистентность, являются проблемой для врачей и пациентов. Проблема достоверности положительных результатов исследований име­ет важное значение и для скрининга донорской крови.

Появление на российском рынке зарегистрированных в установленном по­рядке и разрешенных к применению наборов реагентов для определения антител классов и IgG к отдельным антигенам Treponema pallidum методом иммуно­блота (вестерн-блота - western blot) значительно расширило возможности вери­фикации лабораторного (а на его основе - клинического и эпидемиологического) диагноза сифилиса. Стандартизации и повышению качества работы серологиче­ских лабораторий в последние годы уделяется большое внимание. Совершенство­ванию лабораторной диагностики сифилиса посвящено немало работ, в т. ч. имеется и определенный опыт применения иммуноблота.

Все вышесказанное обосновывает целесообразность включения в алгоритм лабораторной диагностики сифилиса подтверждающего теста - иммуноблота (при положительном либо сомнительном результате тестирования крови мето­дом ИФА). Данная система скрининга крови (первичная постановка (ИФА) по­вторная постановка (ИФА) для исключения внутрилабораторной ошибки с ис­пользованием тест-систем более высокой специфичности иммуноблот), которая в течение 20 лет используется в лабораторной службе диагностики ВИЧ-инфек­ции, может быть относительно быстро и с минимальными финансовыми вложе­ниями внедрена в работу серологических лабораторий для диагностики сифилиса.

Учитывая результаты исследований, проведенных нашими соотечествен­никами и зарубежными коллегами, по применению иммуноблота и обобщив собственный (с 2006 г.) опыт, предлагаю свой взгляд на про­блему серологической диагностики данного заболевания и возможность ис­пользования иммуноблота (предназначен для точной идентификации патоген-специфических антител) в качестве подтверждающего метода.

Для лабораторной службы первоочередной задачей является получение до­стоверного результата исследования биоматериала (крови, ликвора), что в усло­виях развития медицины (государственной и негосударственной) и системы медицинского страхования возможно при стандартизации лабораторных ис­следований. Стандартизация достигается следующим путем:

  • стандартизация преаналитического этапа исследования - как за пределами лаборатории (использование закрытых систем взятия крови и игл-"бабочек", что значительно снижает частоту гемолиза; забор крови в пластиковые пробирки однократного применения; соблюдение сроков хранения и до­ставки проб), так и в самой лаборатории;
  • проведение процедуры анализа образца биоматериала в соответствии с ин­струкцией;
  • использование средств измерений, прошедших метрологический контроль;
  • повторное исследование образцов крови с использованием применяемого метода (например, ИФА) либо иного метода, обладающего более высокой специфичностью (например, в реакции пассивной агглютинации желати­новых частиц, сенсибилизированных очищенными антигенами Tr. pallidum), и (или) иммуноблота в его модификациях для раздельного определения специфических антител классов IgM и IgG к наиболее значимым белкам возбудителя сифилиса;
  • правильная оценка результатов на постаналитическом этапе, их внесение в журнал и бланк результата анализа.

Последний этап является весьма ответственным в деятельности врача ла­боратории, учитывая возможность причинения пациенту морального ущерба при информировании о положительном результате тестирования крови на си­филис, если в последующем он признается ложноположительным. Несмотря на относительно высокую стоимость анализов при проведении ИФА и иммуноблота, использование комплекса лабораторных тестов вполне оправданно, т. к. этиологическая расшифровка определяет правомочность диагноза и принци­пиально влияет на тактику ведения пациента.

Причины получения ложноположительных результатов хорошо известны и подразделяются на две группы: не зависящие от лаборатории и зависящие от лаборатории.

Наиболее частой причиной недостоверного результата в лаборатории явля­ется повторное использование наконечников к пипеточным дозаторам, проби­рок типа Эппендорф (при аликвотировании образцов) и иммунологических планшетов, применяемых для приготовления промежуточных разведений. В качестве оправдания обычно ссылаются на отсутствие достаточных финансо­вых средств на приобретение, однако это нельзя считать веским аргументом, т. к. пластик относится к расходным материалам однократного применения, и его повторное использование должно быть прекращено.

Особо следует выделить причины ложноположительных результатов, не за­висящие от сотрудников лаборатории. Наиболее часто неправильный результат встречается при определении специфических антител класса и может быть обусловлен наличием ревматоидного фактора, гиперпродукцией IgM при бере­менности, перекрестной реакцией с антигенами других возбудителей, аутоим­мунным процессом, нарушением обмена веществ, гиперлипидемией и др. В данном случае получить достоверный результат анализа позволяет использо­вание ряда лабораторных приемов, а именно:

  • удаление ревматоидного фактора из сыворотки с использованием сор­бента;
  • использование на первом этапе постановки либо в качестве уточняющих тестов высокоспецифичных тест-систем зарубежного или отечественного производства;
  • повторное исследование сыворотки;
  • применение в качестве подтверждающего теста иммуноблота (western blot-IgM), предназначенного для выявления антител именно класса IgM к от­дельным антигенам возбудителя.

Наряду с этим следует помнить, что антитела класса IgM являются показа­телем острого и активного инфекционного процесса. Обнаружение ДНК возбу­дителя (методом полимеразной цепной реакции) либо его антигенов прямыми методами или появление в динамике антител других классов в результате пере­ключения синтеза антител позволяют верифицировать диагноз. При детекции антител класса IgG также может быть получен ложноположительный результат, связанный прежде всего с перекрестным реагированием антигенов и напрямую зависящий от специфичности тест-систем. Для уточнения лабораторного диа­гноза и исключения ложноположительного результата следует применять иммуноблот (western blot-IgG), предназначенный для обнаружения антител класса IgG к отдельным высокоспецифичным белкам патогена.

С целью уточнения лабораторного диагноза и установления частоты лож-ноположительных результатов нами были подвергнуты анализу 295 образцов крови от пациентов, у которых при тестировании крови методом ИФА в раз­личных лабораториях выявлены антитела к Tr. pallidum. Материалом для иссле­дования служила сыворотка крови, взятая с применением закрытых систем в вакуумные пробирки.

Для подтверждения лабораторного диагноза были использованы наборы реагентов для определения антител классов и IgG, содержащие электрофо-ретически разделенные антигены Tr. pallidum: p15, p17, p22, p45 и p47. Из них специфичными являются 4 белка: мембранный белок Tp47, TmpA (полоса на стрипе 45 кДа), мембранный белок Tp17, мембранный белок Tp15. Наличие не­специфической полосы 22 кДа с антигеном Р22 имело принципиальное значе­ние и в ряде случаев объясняло наличие ложноположительного результата, по­лученного при проведении ИФА.

Постановка реакции проводилась в строгом соответствии с инструкцией. Интерпретация результатов выполнялась согласно рекомендациям производи­теля тест-системы с учетом положения полос и их интенсивности.

Все 295 образцов сыворотки крови были подвергнуты исследованию на присутствие антител класса IgG и 290 образцов - на присутствие антител клас­са к специфическим антигенам. Результаты исследования показали, что по результатам подтверждающего теста (блота) 36,2% образцов были позитивны по и 75,6% образцов - по IgG. Три образца имели неспецифическую полосу с антигеном Р22, что позволило сделать заключение об отсутствии лаборатор­ных признаков сифилиса.

При детекции наличие одной четкой полосы, указывающей на присут­ствие специфического антигена, расценивали как положительный результат, который был отмечен в 37 пробах (35,2% от числа позитивных проб). Полоса соответствовала: у 20 чел. - мембранному белку Tp47, 9 чел. - Tp17, 5 чел. -TmpA, 3 чел. - Tp15. У 41 пациента присутствовали 2 специфических белка в различных комбинациях, в остальных случаях - 3 и 4 специфических белка. У 68 пациентов с одной либо двумя положительными полосами, указывающими на присутствие антител класса М, обследованных в динамике, появились спе­цифические антитела класса IgG, что свидетельствовало о переключении синте­за антител и подтверждало развитие инфекционного процесса.

При оценке данных по IgG наличие одной полосы, которое имело место у 27 пациентов (в 12,0% случаев от серопозитивных в блоте), расценивалось как неопределенный (сомнительный) результат. В таких случаях проводили парал­лельную оценку результатов тестирования на присутствие антител класса к специфическим белкам либо рекомендовали обследование в динамике. Нали­чие двух и более полос, указывающих на присутствие антител класса к спе­цифическим белкам, расценивали как положительный результат: у 44 чел. выяв­лены антитела к 2 белкам, у 42 чел. - 3 белкам и у 110 чел. - 4 белкам (р15, р17, р45, р47).

Таким образом, применение иммуноблота показало, что в 25% случаев ре­зультат исследования методом ИФА является ложноположительным, что обос­новывает необходимость применения подтверждающего теста и целесообраз­ность включения иммуноблота в медицинские стандарты.

Т.И. Долгих,руководитель центра, заведующая Центральной научно-исследовательской лабораторией,
Центральная научно-исследовательская лаборатория и Академический центр лабораторной диагностики
ГОУ ВПО "Омская государственная медицинская академия"



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Новые документы

Закупки по 44-ФЗ
Квалификация
Платные услуги
Популярное у экономистов медучреждений
Популярное у главных медсестер

Мероприятия





Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×