Специфическая лабораторная диагностика инфекционных заболеваний: достижения и перспективы

3267
Специфическая лабораторная диагностика инфекционных заболеваний: достижения и перспективы

Широкая распространенность во всем мире инфекционных заболеваний и смертность, особенно среди детей, появление новых, редких или уже забытых болезней обусловливают необходимость постоянного контроля за инфекционными заболеваниями.

Необходимость и важность специфической лабораторной диагностики инфекционных заболеваний не вызывает сомнений. Выявление этиологии заболевания (идентификация и типирование возбудителя, выявление патогенетически значимых маркеров возбудителя - антигенов, токсинов, ферментов и др.) и определение лекарственной устойчивости возбудителя ведет к раннему назначению адекватного лечения, что ускоряет выздоровление, предупреждает осложнения, снижает смертность, а также важно для изучения патогенеза инфекционных заболеваний с целью создания новых лечебных и профилактических препаратов, проведения эпиднадзора. Ценность специфической диагностики возрастает в условиях происходящей смены патогенов вследствие генетической изменчивости и воздействия факторов внешней среды, появления новых и усиления агрессии известных возбудителей, а также популяционных изменений, в частности, роста числа иммунодефицитных состояний, врожденных и перинатальных инфекций, атипичных и хронических форм заболеваний, а также микстинфекций, трудных в диагностике и терапии.

Большинство современных клинических микробиологических лабораторий полагается на сочетание морфологии колоний, физиологические и биохимические/серологические признаки для успешной идентификации микроорганизма на уровне рода или вида. Однако традиционное культивирование недостаточно информативно, довольно часто бывает безуспешным (при предшествующей антибактериальной терапии, медленно растущих микроорганизмах (микобактерии, бруцеллы, йерсинии), некультивируемых возбудителях, а также там, где не используются необходимые специализированные культуральные методики (Chlamidia, Campylobacter, C. bernetti, H. pylori)). При этом оно занимает несколько дней, и в этот период терапия больному назначается эмпирически.

Молекулярная биология для решения различных аналитических задач располагает широким спектром методик и их вариантов, в т. ч. направленных на выявление антигенов, ферментов, токсинов и нуклеиновых кислот возбудителя, с помощью которых можно существенно улучшить диагностику, повысив эффективность и скорость выполнения анализа, и оптими¬зировать последующее лечение инфекционного больного. В частности, это иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы, непрямая гемагглютинация и реакция связывания комплемента, латекс- и коагглютинация, иммуноблотинг, иммунохроматография, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и др. Часть из них имеет большую чувствительность, чем культуральные методы, другие, в частности молекулярно-биологические методы, могут давать сравнительно схожие с культуральным методом результаты.

В мировых тенденциях создания методов специфической диагностики инфекционных заболеваний можно выделить 2 основных направления:

  • высокотехнологичные разработки с максимальной автоматизацией, высокой чувствительностью, специфичностью, производительностью, с использованием микро- и нанотехнологий выявления ДНК/РНК, протеинов или мелких молекул, желательно мультиплексностью, для использования в крупных специализированных лабораториях;
  • создание быстрых, простых (постановка вручную, даже неквалифицированным персоналом) портативных бесприборных методов, также высокой чувствительности и специфичности, но пригодных для использования практически везде, в т. ч. у постели больного (lab-in-a point-of care), с использованием портативных чипов (lab-on-a-chip) и картриджей (lab-on-a card), что сейчас стало возможным также благодаря использованию высоких технологий. В рамках последней тенденции разработаны и относительно недорогие тест-системы, причем оптимальным считается использование биоматериалов от больных, полученных неинвазивным способом.

Для создания методов диагностики используются достижения науки последних 20 лет, в частности, в области генетики и протеомики, в области разработки микро-, нано- (вплоть до атто-) платформ, миниатюризация (биосенсоры, биочипы, микрофлюидные системы, нанотрубки), повышение чувствительности, специфичности и наглядности, обеспечение мультиплексности анализа, его автоматизации и универсальности тест-систем. Нередко используются сочетания различных технологий.

Диагностические микроматрицы различаются по характеру иммобилизованных молекул: ДНК-микроматрицы, антительные микроматрицы и микроматрицы на основе мелких молекул. Главные этапы работы с микроматрицами состоят в приготовлении, производстве, использовании их для скрининга и анализа.

ДНК-микроматрицы могут использоваться для определения ДНК патогенного микроба, для ресеквенирования генома любого патогена с целью диагностики и для выявления генов, вовлеченных в заболевание.

В целом, перечень молекулярно-биологических методов в медицинской микробиологии достаточно широк и постоянно пополняется новыми методиками: гибридизация нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) в жидком или твердофазном формате (в последнем случаев это фильтр-гибридизация, сэндвич-гибридизация, т 811и-гибридизация); ПЦР (специфическая, мультиплексная, гнездная/полугнездная); ПЦР широкого спектра (для определения таксономической группы микроорганизмов); обратно-транскрипционная ПЦР (КТ-РСК); ПЦР в реальном времени; секвенирование ДНК (метод концевых цепей и метод химической деградации). Продолжают появляться новые методики молекулярной диагностики.

Антительные микроматрицы используются для детекции протеинов патогена или антигенов в пробе. В настоящее время иммуноанализ является наиболее распространенным методом в лабораторной медицине.

Микроматрицы на основе мелких молекул дают новые возможности в дифференциации патогенов и для идентификации лекарственных препаратов.

Большие перспективы в диагностике инфекционных заболеваний имеют нанотехнологии. В медицине они начали применяться и позволяют осуществлять диагностику на клеточном и молекулярном уровне. В настоящее время классификация диагностических нанотехнологий следующая:

  • визуализация наночастиц (микроскопия атомных сил, сканирующая микроскопия);
  • биометки наночастиц;
  • биочипы/микрометоды на основе нанотехнологий;
  • диагностика нуклеиновых кислот на основе наночастиц;
  • нанопротеомная диагностика;
  • биоштрихкод метод;
  • технологии на основе нанопор;
  • ДНК-наномашины для молекулярной диагностики;
  • иммунометоды на основе наночастиц;
  • нанобиосенсоры;
  • сочетания технологий множественной диагностики.

Хотя потенциальные возможности применения нанотехнологий не ограничены, наиболее важные области их использования - это детекция микроорганизмов, в т. ч. особо опасных, биомаркеров, опухолей, биосепарация специфических клеточных популяций. Эти технологии превосходят существующие диагностические методы и позволяют как осуществлять точную диагностику "у постели больного", так и создавать персонализированную медицину. Некоторые из этих технологий уже сейчас могут быть внедрены в существующую молекулярную диагностику в виде биочипов. Использование наночастиц в качестве метки или ярлыка позволяет определять инфекционные агенты в малом объеме пробы напрямую, с высокой чувствительностью, специфичностью, быстрее и дешевле, чем существующие методы, осуществлять современную мультиплексную лабораторную диагностику. В молекулярной диагностике наиболее часто используют наночастицы золота, ССБ и магнитные наночастицы. В качестве биометок наночастиц могут использоваться также частицы серебра, кварцевые наночастицы для метки антител, SERS-нанотаг, ДНК-нанотаг, флюоресцирующие лантаниды, частицы перфлюорокарбона, органические наночастицы и др.

Технология Quantum Dot (QD) сейчас наиболее широко используется. QD - это неорганические флуорофоры, которые дают значительные преимущества по сравнению с обычно используемыми флуоресцентными маркерами. Они имеют высокую чувствительность, широкий спектр, стабильную флуоресценцию и не требуют лазеров. Возможно их применение в молекулярной диагностике и генотипировании, в мультиплексной диагностике и интеграции диагностики с терапией. Наиболее важное потенциальное применение QD - диагностика опухолей и определение вирусов. Выявление гибридизации одной молекулы может быть достигнуто использованием многоцветного ОБ на олигонуклеотиде в качестве нанопробы. Этот метод может применяться, в частности, для генетического анализа патогенности возбудителя сибирской язвы путем одновременного определения множества важных последовательностей.

Метод спектроскопии, основанный на SERS (surface enhanced Raman scattering - комбинационное рассеяние света (эффект Рамана)) с использованием серебряных наночастиц, которые значительно усиливают сигнал, разработан для быстрого выявления следовых уровней вирусов с высокой степенью чувствительности и специфичности. Метод обеспечивает быструю (менее 60 с) диагностику и характеристику репродуцирующихся вирусов без манипуляции с ними. Этот новый метод может выявить спектральные различия между вирусами, вирусными штаммами и вирусами с делецией генов в биологической среде.

Биометод на основе биоконъюгированных наночастиц для подсчета in situ патогена может определять единичную бактерию в течение 20 мин.

Нанобиосенсоры - это наносенсоры, использующиеся для детекции химических или биологических материалов. Наноматериалы являются исключительно чувствительными химическими и биологическими сенсорами.

Недавно предложенная технология Cantilever наиболее многообещающая. Методика усиливает и расширяет возможности ДНК- и протеиновых методов и применяется в анализе генома, протеомике и молекулярной диагностике. Нанокантилеверы важны для создания нового класса ультрамалых сенсоров для детекции вирусов, бактерий и других патогенов, могут обеспечить в реальном времени постоянный мониторинг клинических параметров у конкретного пациента.

С учетом того что многие инфекционные болезни имеют смешанную этиологию, большое значение придается мультиплексности анализа. Мультиплексность анализа (выявление комплекса параметров) является одним из основных требований, предъявляемых к современным и перспективным методам диагностики.

Как сложные, так и простые методы позволяют осуществлять мультиплексный анализ и дифференциальную диагностику, что особенно важно при кишечных и респираторно-вирусных инфекциях. В настоящее время есть хорошие рациональные идеи в создании мультиплексных панелей.

Нанотехнологии в чипе - это система полного химического анализа (TAS – Total chemical Analysis Sistems), позволяющая осуществлять диагностику в ручном режиме. Пока число образцов не очень велико, но оно быстро увеличивается. Перспективные модели для дифференциальной диагностики лихорадочных заболеваний (малярия, корь и лихорадки Денге, тифозные и риккетсиозные инфекции - выявление антигенов, антител и нуклеиновых кислот) и кишечных инфекционных заболеваний будут иметь важное значение для адекватной своевременной терапии. В нашей стране разработаны и производятся биочипы для диагностики туберкулеза и выявления устойчивости микобактерий к антибиотикам.

В целом, будущее нанотехнологий, и в частности нанобиосенсоров, заключается, очевидно, в разработке новых недорогих, удобных, надежных, простых, быстрых методик детекции и количественной характеристики биопроб, в дальнейшей миниатюризации биочипов (вплоть до создания "лаборатории в чипе" (lab-on-chip – LOC), создании мобильных микроскопических сенсоров для т угто диагностики высокого разрешения, замещении ими ПЦР и флуоресцентного анализа, автоматизации мультиплексного анализа.

К перспективным методикам, в частности, относятся ИФА БПТ ИммуноКомб, ИФА - иммуноблот, другие иммунохроматографические тест-системы, методы непрямой агглютинации (латекс-агглютинация, коагглютинация, РНГА и др.).

К сожалению, часть методов имеет ограниченный перечень тест-систем, что ограничивает их широкое использование. Более выигрышную позицию занимают латексные и коагглютинирующие диагностикумы, производимые разными фирмами, предназначенные для выявления значительно более широкого диапазона возбудителей, в т. ч. наборы для групп заболеваний (кишечных инфекций, заболеваний дыхательных путей, менингитов, заболеваний мочеполового тракта и др.). Постановка этих тестов занимает от 2 до 30 мин, проста, удобна, результаты оцениваются невооруженным глазом, отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. Использование таких тестов позволяет увеличить частоту подтверждения диагноза при обследовании больных в 2-4 раза в сравнении с использованием традиционного бактериологического или вирусологического метода.

Таким образом, в настоящее время существуют реальные возможности совершенствования специфической лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Мировой прогресс в сфере биотехнологий позволил создать ряд методик, использование которых отвечает требованиям современной медицины.

О.Ф. Белая,
д-р мед. наук, проф., зав. лабораторией по изучению токсических и септических состояний
при кафедре инфекционных болезней МПФ Первого Московского медицинского университета им. И.М. Сеченова



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Интервью

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Врачей обяжут сообщать о потенциальных донорах

Алексей ПИНЧУК: журналу «Здравоохранение». Главные темы беседы – изменение правового поля донорства в России




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2016. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль