Методические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧ

500

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови при мониторинге ВИЧ-инфекции

Методические рекомендации1

7.1.8. Хранение и транспортировка образцов крови.

Необходимо, чтобы образцы крови были вовремя доставлены в лабораторию. Нарушение времени доставки может повлиять на результат исследования и его дальнейшую интерпретацию.

При транспортировке образца закрытые пробирки с кровью должны находиться в вертикальном положении в контейнере, который в случае повреждения пробирки будет предотвращать разлитие крови. При хранении образцов очень важно соблюдать температурный режим. Избегайте замораживания или перегревания образцов, так как нарушение температурного режима влияет на результаты иммунофенотипирования. Температура при транспортировке, хранении и обработке образцов должна быть 18–23 ˚C. После забора крови образцы должны быть доставлены в лабораторию как можно скорее.

Для иммунофенотипирования нельзя хранить образцы крови с антикоагулянтом в холодильнике! После хранения образцов крови в холодильнике в течение 6 часов наблюдается снижение относительного количества CD4 Т-лимфоцитов.

Высокие температуры также оказывают влияние на количество клеток венозной крови. В летний период времени, когда уличная температура колеблется в диапазоне 30–32 °С, наблюдается дегрануляция гранулоцитов и, как следствие этого, значительное снижение их количества.

Проводить исследование образцов крови с  К3-ЭДТА рекомендуется не позднее чем через 6 часов после взятия образца, так как при более длительном хранении происходит слипание и агглютинация тромбоцитов и их прилипание к нейтрофилам, эти явления прогрессируют по мере увеличения времени с момента взятия крови. При этом происходит увеличение показателя общего количества лейкоцитов и снижение количества тромбоцитов.

В случае иммунофенотипирования только лимфоцитов возможно проводить исследования, но не позднее 48 часов при условии правильного хранения образца. При получении таких образцов необходимо использовать одноплатформенный метод для подсчета абсолютного количества клеточных популяций.

7.1.9. Рекомендации мероприятий по получению и приему образцов в лаборатории.

При получении образцов в лаборатории проверьте их соответствие направлениям. Запишите все образцы в журнал регистрации, включая следующую информацию: Ф. И. О. пациента, возраст, пол, входящий номер образца, номер истории болезни, откуда и кем направлен. Время и дату забора крови и поступления её в лабораторию.

У каждого пациента должен быть свой индивидуальный номер — номер пациента. Если пациент обследуется впервые, ему присваивается индивидуальный номер.

7.1.10. Пригодность образцов крови.

При получении образца цельной крови запишите данные о его состоянии (Proyecto de Acreditacion segun ISO 15.189.).

Проверяйте и документируйте качество образцов, доставленных в лабораторию. Уведомляйте направляющие учреждения в случаях некорректно полученных образцов.

Осмотрите пробирку с кровью сразу после того, как ее доставили в лабораторию. Если пробирка холодная или горячая на ощупь, но кровь в ней не заморожена и не имеет явных признаков гемолиза, исследование образца допускается, однако в этом случае необходимо сделать соответствующую отметку в регистрационном журнале и отчетном документе.

Не подвергайте образец быстрому охлаждению или нагреванию, так как это может негативно повлиять на результаты иммунофенотипирования. Образец крови, доставленный в лабораторию для иммунофенотипирования, должен быть представлен пробиркой с антикоагулянтом K3EDTA или K2EDTA, допускается использование гепарина.

При осмотре пробирки с образцом для иммунофенотипирования необходимо обратить внимание на целостность пробирки. При нарушении целостности пробирки исследование иммунного статуса невозможно из-за нарушения соотношения плазмы и форменных элементов.

Исследование образца не проводится в следующих случаях:

• Если кровь гемолизирована или заморожена.

• Если кровь имеет видимые сгустки.

• Если с момента забора крови прошло более 48 часов.

• Нарушение целостности пробирки.

Во всех перечисленных случаях необходимо запросить новый образец. Документируйте все случаи неподходящих для исследования образцов и сделайте отметку в отчете о результатах обследования.

7.2. Приготовление аналитических проб для исследования на проточном цитофлуориметре.

7.2.1. Моноклональные антитела.

Необходимость изучения набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для строго определенных популяций клеток привело к развитию гибридомных технологий и созданию моноклональных антител (МА), с помощью которых появилась возможность типировать клетки. В  1980-х годах прошлого века на Международом рабочем совещании по антигенам лейкоцитов человека было предложено объединить МА в группы или кластеры в зависимости от того, какую антигенную структуру на клеточной поверхности они распознают.

Понятие CD-Claster of Differentiation — «кластер дифференцировки» первоначально означало набор МА, которые независимо от эпитопной специфичности, распознают одну и ту же структуру на клеточной поверхности. В настоящее время под CD понимают саму структуру на клеточной поверхности. Меченые флуорохромом МА позволяют проводить качественный и количественный анализ поверхностных антигенов.

В настоящее время производителями разных фирм предлагается большой выбор МА, меченых различными флуорохромами. Это дает возможность исследователю, проводя анализ одного образца подобрать, необходимый набор МА для получения информации о нескольких антигенах, находящихся на поверхности клеток, соответственно позволяет исследователю судить о субпопуляционном составе и активности клеток (табл. 3).

Таблица 3
Наиболее часто используемые флуорохромы для прямой конъюгации с моноклональными антителами
Флуорохромы Длина волны возбуждения, нм Эмиссия, нм
Флуоресцеина изотиоцианат (FITC) 488 525
Фикоэритрин (PE) 488 575
Алофикоцианин (APC) 633/635 680
Тандемные красители:
Фикоэритрин — Техасский красный (ECD) 488 610
Фикоэритрин — Cy5 (PC5) 488 675
Фикоэритрин — Cy7 (PC7) 488 790
Аллофикоцианин — Cy7 (APC7) 633/635 700

7.2.2. Выбор панели моноклональных антител для мониторинга ВИЧ-инфекции.

Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови нельзя использовать одноцветные протоколы и панели моноклональных антител.

Это связано с тем, что разные клетки могут экспрессировать одинаковые рецепторы. Например, моноциты положительные по CD4, а натуральные киллеры по CD8 (рис. 2)2.

Методические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 2.Экспрессия CD8 на лимфоцитах периферической крови (Хайдуков С.В., 2005 г.)

На рисунке видно, что при использовании одноцветной панели количество CD8 Т-клеток больше, чем при двухцветной комбинации флуорохромов.

В образцах крови ВИЧ-инфицированных пациентов могут возникнуть проблемы с корректным выбором зоны анализа лимфоцитов. Это может быть связано с морфологическими изменениями лимфоцитов у этих пациентов и неполном лизисе эритроцитов. В этих случаях результат будет ошибочный (рис. 3). Для избежания получения некорректных результатов необходимо использовать трехцветные панели моноклональных антител с выбором зоны анализа лимфоцитов по экспрессии CD45.

Методические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 3.Светорассеивание у  ВИЧ-положительных и  ВИЧ-отрицательных пациентов (F. Mandy, 2004)

Для мониторинга ВИЧ-инфицированных пациентов используются панели, содержащие маркеры для подсчета общих Т-лимфоцитов и их субпопуляций: Т-хелперов и  Т-цитотоксических клеток. В педиатрической практике при иммунологическом обследовании ВИЧ-инфицированных детей дополнительно добавляется пробирка для определения общего количества В-клеток (с CD19) (табл. 4).

Таблица 4

Панели моноклональных антител для мониторинга ВИЧ-инфекции

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови Панели моноклональных антител
двухцветные трехцветные четырехцветные
Изотипический контроль IgG/IgG Нет Нет
Выбор зоны анализа для лимфоцитов CD45/CD14 Нет Нет
Т-хепреры CD3/CD4 CD45/CD3/CD4 CD45/CD3/CD4/CD8
Т-цитотоксические CD3/CD8 CD45/CD3/CD8
У детей CD3/CD19 CD45/CD3/CD19 CD45/CD3/CD19/(CD16 56)

При первичном обследовании ВИЧ-инфицированных пациентов рекомендуется дополнительно исследовать следующие популяции лимфоцитов: общие В-клетки, натуральные киллеры ( NK-клетки), NK\ T-клетки, активированные Т-клетки и активационные маркеры. Определение количества активированных клеток и активационных маркеров имеет большое значение для прогноза и течения ВИЧ-инфекции (табл. 5).

Таблица 5

Дополнительные панели моноклональных антител

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови Панели моноклональных антител
двухцветные трехцветные четырехцветные
Изотипический контроль IgG/IgG Нет Нет
Выбор зоны анализа для лимфоцитов CD45/CD14 Нет Нет
Общие Т и В клетки CD3/CD19 CD45/CD3/CD19 CD45/CD3/CD19/(CD16 56)
NK- и NK\ T-клетки CD3/(CD16 CD56) CD45/CD3/(CD16 56)
Активированные Т-клетки CD3/ HLA-DR CD45/CD3/ HLA-DR CD45/CD3/ HLA-DR
Маркер активации (регулирует адгезию, пролиферацию и продукцию цитокинов) CD45/CD8/CD38 CD45/CD3/CD8/CD38

7.2.3. Подготовка образца периферической крови для исследования на проточном цитофлуориметре.

Стандартная процедура подготовки пробы для иммунофенотипирования проводится при комнатной температуре (18–23 °С) и включает:

дозирование крови и реагентов;инкубацию крови с моноклональными антителами;лизис и фиксацию образца.

Она может быть выполнена как вручную (в ламинарном шкафу), так и в автоматическом режиме.

Для получения корректных результатов необходимо соблюдать следующие правила:

1. Перед началом работы подготовить рабочее место.

2. Достать из холодильника моноклональные антитела, чтобы они согрелись до комнатной температуры (18–23 °С).

3. Приготовить пипетки (необходимых объемов), пробирки, наконечники, штативы, литическую жидкость для лизирования эритроцитов, необходимые растворы, емкость для сбрасывания наконечников, штатив с образцами крови.

4. Все образцы должны быть промаркированы (соответственно СОПам, разработанным в вашей лаборатории).

N.B.! На рабочем столе не должно быть ничего лишнего!

5. Пробирки для приготовления аналитических проб должны быть промаркированы в соответствии с образцами крови и вносимыми в них антителами.

6. Согласно маркировке внесите раствор моноклональных антител, меченых флуорохромами в подготовленные пробирки, не касаясь их стенок. При многоцветном анализе допускается смешивание нескольких моноклональных антител окрашенных разными флуорохромами в одной пробирке. Объем вносимых антител должен соответствовать рекомендациям фирмы производителя и разработанным в лаборатории СОПам.

7. Перед дозированием крови для равномерного распределения клеток аккуратно перемешайте кровь, переворачивая плотно закрытую пробирку несколько раз. Встряхивание крови на вортексе приводит к неверным результатам вследствие возможного гемолиза и разрушения клеток.

N.B.! В случае попадания капель крови на стенки пробирки их следует немедленно удалить.

8. Хорошо перемешивайте кровь и реагенты на Вортексе.

9. Инкубируйте образцы в темном месте тот период времени, который рекомендован фирмой производителем.

10. Для выполнения лизиса эритроцитов внесите согласно инструкции фирмы производителя лизирующий раствор. Для одноплатформенной технологии подсчета абсолютного количества CD4 Т-клеток необходимо использовать безотмывочный метод.

11. При одноплатформенной технологии определения абсолютного количества клеточных популяций флаконы с суспензией частиц для абсолютного счета перед внесением в пробирки (если они не были предварительно внесены производителем, например — пробирки TRU COUNT, BD) необходимо тщательно встряхивать.

ВНИМАНИЕ! Обязательным условием является строгое соблюдение объемов крови и суспензии с частицами.

Несоблюдение объемов частиц и образца крови приводит к неверным результатам. Для избежания ошибок рекомендуется пользоваться методом обратного дозирования и раскапывать кровь и частицы одной пипеткой.

Методика обратного дозирования: рекомендуется для более точного соблюдения объемов. Электронные пипетки, как правило, имеют автоматический режим обратного дозирования Pr. В данном случае следуйте инструкции производителя. Методика обратного дозирования может быть выполнена с использованием обычной пипетки. Нажмите на контрольную кнопку глубже (шаг 2), опустите наконечник в емкость с дозируемой жидкостью, затем медленно отпустите кнопку. Таким образом, в наконечнике окажется дополнительный объем дозируемой жидкости. Выпустите жидкость, нажимая контрольную кнопку, как обычно (шаг 1). Таким образом, в наконечнике останется небольшой объем жидкости. Не отпуская кнопки, снова опустите наконечник в емкость с дозируемой жидкостью и наберите новый объем. Дозируйте его, как и в первый раз. В наконечнике должен постоянно оставаться небольшой объем жидкости.

11. После внесения в пробы моноклональных антител, реагентов для лизиса эритроцитов и перед проведением анализа на проточном цитометре необходимо встряхивать пробирки с пробами на вортексе.

12.Готовые образцы могут храниться в холодильнике при температуре 2–8 °С не более 24 часов.

N.B.! Персонал, занимающийся подготовкой проб для анализа на проточном цитофлуориметре, должен быть сосредоточен на данной манипуляции и не отвлекаться на телефонные звонки, разговоры и т. д.

7.2.4. Методика выявления погрешности дозирования.

Процедура позволяет убедиться, что персонал, готовящий пробу, каждый раз дозирует одинаковый точный объем крови. Для этого проводится 20-кратное взвешивание капли крови с подсчетом коэффициента вариации (допустимый CV не более 2%). Последовательность действий при выполнении этого метода:

1. Поместите пластиковую емкость для взвешивания на аналитические весы.
2. Обнулите весы.
3. Внесите 50 µL нормальной крови в емкость.
4. Запишите вес крови.
5. Обнулите весы.
6. Повторите шаги 3–5 для всех 20 аликвот. Меняйте наконечники между аликвотами.
7. Рассчитайте % CV.

7.2.5. Метод проверки точности дозирования.

Процедура позволяет убедиться, что дозатор (пипетка) дозирует точный объем жидкости.

Для этого проводится 5-кратное взвешивание капли воды с подсчетом среднего веса (средний вес в пределах 0,0490–0,0510 г). Последовательность действий при выполнении этого метода:

1. Поместите пластиковую емкость для взвешивания на аналитические весы.
2. Обнулите весы.
3. Внесите 50 µL жидкости в емкость.
4. Запишите вес воды.
5. Восстановите баланс весов.
6. Повторите шаги 3–5 для всех пяти аликвот. Меняйте наконечники между аликвотами.

7.3. Калибровка проточных цитофлуориметров и создание протокола анализа.

7.3.1. Калибровка проточных цитофлуориметров.

Большинство современных проточных цитофлуориметров имеют фиксированную оптическую систему и не требуют ежедневной настройки. Но необходимо каждый день проверять ее правильность, используя специальные частицы — стандарты настройки. Для стандартизации настроек используют референсные стандарты (см. раздел «Контроль качества»).

7.3.2. Настройка проточного цитофлуориметра.

Настройка проточного цитофлуориметра состоит из настройки параметров светорассеивания, настройки дискриминатора, настройки параметров чувствительности фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флуоресценции, введение коэффициентов компенсации.

Настройка параметров светорассеяния

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

В большинстве проточных цитофлуориметров используются два канала светорассеяния: сигналы регистрируются от малоуглового (1–190) и под углом 90˚.

Малоугловое светорассеяние (Forward Skatter, FS) — это рассеивание света под малыми углами (1–190) и пропорционально диаметру клетки или исследуемого объекта.

Рассеяние под углом 900 канал бокового светорассеяния (Side Skatter, SS) — регистрирует свет, рассеянный самой клеткой и ее органеллами и помогает характеризовать структуру и гранулярность клетки. Использование двух параметров светорассеяния позволяет выделить в гетерогенной популяции все входящие в нее компоненты. В случае исследования периферической крови это лейкоциты, моноциты и гранулоциты. При этом основные популяции клеток должны быть отображены на гистограмме по двум каналам светорассеяния.

Настройка дискриминатора

Современные проточные цитофлуориметры обладают высокой чувствительностью по малоугловому светорассеянию, т. е. по размерам исследуемых частиц (до 0,2 мкм) и поэтому они регистрируют множество объектов, которые не являются клетками. Особенно это относится к образцам, приготовленным по безотмывочной технологии.

Наличие регистрируемых «теней» от эритроцитов, тромбоцитов и других объектов оказывает влияние на конечный результат анализа, делая его недостоверным.

Поэтому при настройке прибора необходимо ввести ограничения по отображаемым на гистограмме событиям, т. е. задать границы чувствительности цитофлуориметра.

Для этих целей служит дискриминатор. Это ограничение, как правило, ставится на канал Forward Skatter (малоугловое светорассеяние). Необходимо ввести такие значения, чтобы были видны все популяции клеток анализируемого образца, а дебрис не попадал в зону анализа. Необходимо помнить, что высокие значения дискриминатора могут удалить часть исследуемой популяции клеток, что также может привести к недостоверным результатам.

Настройка параметров фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флуоресценции

Для настройки напряжения ФЭУ можно использовать неокрашенную лизированную кровь или отрицательный контроль, который представляет собой клетки образца, окрашенные неспецифическими антителами, меченными теми же флуорохромами, с которыми предстоит работать (изотипический контроль). Настройка цитофлуориметров осуществляется вручную или в автоматическом режиме. Современные цитофлуориметры для многоцветного анализа имеют программное обеспечение, которое позволяет проводить автоматическую настройку напряжения ФЭУ. Для этого используются калибровочные частицы.

Перед настройкой напряжения на ФЭУ необходимо выключить цветовую компенсацию (все показатели компенсации должны быть равны нулю).

При использовании неокрашенной лизированной крови напряжение следует настраивать таким образом, чтобы популяция неокрашенных лимфоцитов (аутофлуоресценция) была полностью видна и располагалась внутри нижнего квадранта на двухпараметровых графиках. В настоящее время принято, что неокрашенные клетки и клетки негативного контроля должны попадать в первую декаду на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции по всем задействованным каналам, т. е. располагаться в центре первой декады (рис. 4, 5). Необходимо помнить, что неспецифическое взаимодействие антител различных классов с поверхностью клеток-мишеней неодинаково. Поэтому антитела для контрольного образца должны быть того же изотипа, что и специфические антитела, используемые для анализа.

Построение протокола для настройки параметров ФЭУ

Первая гистограмма строится по каналам светорассеяния FS, SS для выбора зоны анализа. Необходимо установить дискриминатор. Далее строятся одно- и двухпараметрические гистограммы с используемыми каналами флуоресценции.

Методические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 4.Настройка напряжения ФЭУ по неокрашенной лизированной кровиМетодические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 5.Ошибки при настройке напряжения ФЭУ

При правильно настроенном напряжении популяция неокрашенных лимфоцитов (аутофлуоресценция) полностью видна и располагается в первой декаде логарифмической шкалы на гистограмме и  двух-параметровом графике.

Ошибкой является слишком высокое и слишком низкое напряжение. Высокое напряжение может привести к ложноположительным, а низкое — к заниженным результатам.

Введение коэффициентов компенсации

Флуорохромы излучают свет, который проходит более чем через один оптический фильтр прибора. Например, FITC (изотиоцианат флуоресцеина) излучает не только зеленый, но и оранжевый свет, который проходит через оранжевый оптический фильтр и генерирует сигнал в этом детекторе.

При многоцветном анализе для устранения влияния других флуорохромов на флуоресценцию, регистрируемую каждым конкретным детектором, необходимо настраивать цветовую компенсацию.

Под цветовой компенсацией понимают электронную коррекцию флуоресценции, направленную на устранение влияния других флуорохромов на интенсивность флуоресценции, регистрируемой данным детектором.

Например: используя для многоцветного анализа панклеточные маркеры CD19 и CD3 (окрашенные фикоэритрином — PE и FITC соответственно), можно увидеть дубль-позитивные клетки, хотя они в природе не встречаются. Связано это с тем, что спектры, испускаемые флуорохромами, не бывают точечными, а имеют свое распределение в определенном диапазоне. В связи с этим оператору необходимо провести вычитание из интенсивности флуоресценции каждого ФЭУ дополнительного сигнала, генерируемого другими флуорохромами, что является коэффициентом компенсации.

Для настройки световой компенсации можно использовать автоматизированное программное обеспечение и настроечные реагенты, предлагаемые фирмами — производителями цитофлуориметров. Однако реагенты очень дорогие, и постоянное их использование приводит к удорожанию стоимости исследования. Кроме того, в процессе проведения исследования образца очень часто есть необходимость введения новых коэффициентов компенсации для конкретного случая. В связи с этим мы остановимся более подробно на настройке световой компенсации и введении коэффициентов компенсации вручную.

Настройка световой компенсации вручную

Для настройки световой компенсации вручную можно использовать частицы или клетки, окрашенные соответствующим набором флуорохромов и имеющие флуоресцентный сигнал, соответствующий самому яркому сигналу клеток в исследуемых образцах. Наиболее оптимальным является использование антител CD8, связанных с разными флуорохромами и их анализ в двухпараметрическом режиме. Можно использовать антитела, которые относятся к двум непересекающимся кластерам дифференцировки. Например: CD3-FITC и  CD19-РЕ. При использовании для настроек компенсации слабо экспрессируемых маркеров есть вероятность получить псевдодубльпозитивные события. Это связано с тем, что большинство иммунологических исследований проводятся с использованием логарифмической шкалы и чем выше экспрессия маркеров, тем большее количество событий попадает в зону двойного окрашивания. В этих случаях приходится проводить дополнительную компенсацию для исключения «псевдопозитивных» сигналов.

Подготовка проб для настройки компенсации

Для настройки трехцветного протокола, например, при использовании МА, конъюгированных с флуорохромами FITC, РЕ, PC5, вам необходимо иметь 4 пробирки с клетками или частицами в них.

Первая пробирка с неокрашенными клетками для настройки напряжения ФЭУ, как описано выше.
Вторая окрашивается только CD8-FITC.
Третья — только CD8-РЕ.
Четвертая — только CD8-РС5.

Для настройки параметров ФЭУ и компенсации используйте кровь здорового человека и лизирующий раствор, который вы будете использовать в дальнейшем для анализа. Количество необходимых реагентов, время инкубации и т. д. используется согласно прописи подготовки проб.

Для четырехцветного анализа вам потребуется пятая пробирка с клетками, окрашенными четвертым флуорохромом и т. д.

Построение протокола для настройки компенсации

Первая гистограмма строится по каналам светорассеяния.Далее следуют двухпараметрические гистограммы:FL1-FL2;FL1-FL4;FL2-FL4.

Затем каждая гистограмма разбивается на 4 квадранта, для определения значения MEAN, для каждого типа флуоресценции.

Значение MEAN — параметр, который отражает среднестатистическое положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном канале флуоресценции или светорассеяния.

После настройки напряжения ФЭУ по всем необходимым для выполнения исследования каналам последовательно анализируйте пробирки с клетками, окрашенными CD8-FITC, CD8-PE, CD8-PC5и т. д. по необходимости. Настраивайте цветовую компенсацию так, чтобы популяция, окрашенная CD8-FITC, определялась только в канале FL1-FITC и не определялась в других каналах, а среднее значение (MEAN) флуоресценции FL1-FITC в канале FL2-РЕ и других каналах было равно среднему значению флуоресценции негативной популяции. На двухпараметрических гистограммах клетки, меченые CD8-FITC, должны располагаться в соответствующем квадранте, не попадая внутрь двухположительного квадранта, таким образом, чтобы воображаемая линия, соединяющая центры окрашенной и негативной популяции была параллельна соответствующей оси.

Далее проделайте эту процедуру поочередно с другими пробирками, где клетки окрашены другими флуорохромами.

Затем в чистую пробирку добавьте по 30–40 мкл окрашенных маркеров (из  2-й, 3-йи т. д.). Перемешайте взвесь и проанализируйте (рис. 6, 7).

Методические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 6. Настройка цветовой компенсацииМетодические рекомендации лабораторной диагностики ВИЧРис. 7. Настройка цветовой компенсации

Существуют правила введения коэффициентов компенсации.

I правило: коэффициенты компенсации введены правильно, если MEAN 1 квадранта равен MEAN 3 квадранта по оси Х, а MEAN 4 квадранта равен MEAN 3 по оси Y. (рис. 7а).

II правило: если нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны быть приблизительно параллельны осям X и Y, образуя прямоугольник.

В случае недокомпенсации можно получить завышенный результат за счет ложнопозитивных клеток. MEAN 4 квадранта больше, чем MEAN 3 квадранта по оси Y, а MEAN 1 квадранта больше, чем MEAN 3 квадранта по оси Х.

В случае перекомпенсации можно получить заниженный результат за счет потери позитивных клеток.

MEAN 3 квадранта больше, чем MEAN 4 квадранта по оси Y, а MEAN 3 квадранта больше, чем MEAN 1 квадранта по оси Х (рис. 7в).

Необходимо менять коэффициенты компенсации после изменения напряжения ФЭУ или замены оптических фильтров, так как между ними существует взаимосвязь.

При изменении чувствительности по одному из каналов флуоресценции изменяется отображение флуоресценции на двухпараметрических гистограммах. Так, повышая или понижая чувствительность по одному из каналов, необходимо изменить и соответствующий этому каналу коэффициент компенсации.

При использовании частиц для настройки цветовой компенсации необходимо проверить правильность компенсации исследованием окрашенных клеток.


1Проект. МР разработаны СНИО ЭП СПИД ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора (Л.В. Серебровская, О.Н. Хохлова, Л.А. Иванова, Н.В. Герасимова). Утверждены ученым советом ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора 18 ноября 2014 года. Продолжение. Начало см.: Справочник заведующего КДЛ. 2015. № 2. С. 45–78.>> вернуться в статью2Представлен в черно-белом варианте. – Примеч. ред. >> вернуться в статью



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль