text
Портал для медицинских работников

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

  • 5 декабря 2015
  • 255

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе состоит из нескольких этапов и позволяет идентифицировать уникальные для каждого пациента мишени.

Определение клональных реаранжировок

Для определения клональных реаранжировок использовались стандартные наборы меченных флуоресцентной меткой праймеров для генов дельта (TCRD), гамма (TCRG), бета (TCRB), цепей Т-клеточного рецептора, перестроек тяжелой (IGH) и легкой каппа (IGK) цепи IG в соответствии с протоколом BIOMED-2 (таблица).

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Моноклональные образцы имеют одинаковую длину ПЦР-продуктов и регистрируются в виде одного пика (моноаллельная реаранжировка) или двух пиков (биаллельная реаранжировка). В случае поликлональности образцов регистрируется множество пиков в виде Гауссовского распределения ввиду разницы длины амплификатов. На данном этапе чувствительность выявления опухолевых клеток не превышает 10-1-10-2 (чувствительность варьирует для разных мишеней).

Мишень

Реаранжировки

TCRD

VD — JD / DD2 — JD/ VD — DD3/ DD2 — DD3

TCRG

VG — JG

TCRB

VB — JB /DB — JB

IGH

VH — JH / DH — JH

IGK

Vk — Jk / Vk — KDE / Intron RSS — KDE

В нашей лаборатории методом ПЦР с последующим проведением фрагментного анализа проводится определение минимальной резидуальной болезни (МРБ) у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). В качестве примера приведены результаты исследования образца костного мозга пациента К., 37 лет, с диагнозом В-ОЛЛ, у которого в дебюте заболевания были выявлены клональные реаранжировки по генам TCRD и IGH (рис. 1).

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 1. Данные фрагментного анализа продуктов амплификации генов TCRG, TCRB, TCRD, IGH, IGK. 1. Реаранжировок по генам TCRG не выявлено. 2. Реаранжировок по генам TCRB не выявлено. 3. Выявлены клональные реаранжировки по генам TCRD. 4. Выявлены клональные реаранжировки по генам IgH / VH-JH полные перестройки. 5. Реаранжировок по генам IgH / DH-JH неполные перестройки не выявлено. 6. Реаранжировок по генам IGK не выявлено

Гетеродуплексный анализ и секвенирование клональных продуктов


Для выделения моноклональных продуктов проводился гетеродуплексный анализ. Синтез ПЦР-продуктов для гетеродуплексного анализа выполняли с использованием немеченных праймеров. Полученные амплификаты подвергали денатурации при высоких температурах (95 °С в течение 5 мин) с последующей ренатурацией в течение 1 ч при температуре 40 °С (термоциклер BioRad, США). Элекрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле при комнатной температуре (50V, 6–8 ч), с последующей окраской геля бромистым этидием (30 мин). Гомодуплексы (клональные продукты) определяются в виде одной яркой полоски в области, соответствующей длине моноклонального продукта, в то время как гетеродуплексы определяются в виде мазка (рис. 2). Яркие полоски соответствующей длины, представляющие собой моноклональные продукты, вырезали из геля, помещали в пробирки типа Эппендорф, после чего добавляли деионизованную воду в количестве, необходимом для полного покрытия геля, и термостатировали при температуре 65 °С в течение 30 мин.

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 2. Гетеродуплексный анализ. А. Электрофореграмма ПЦР-продуктов: М — маркер молекулярного веса; п — поликлональный продукт; м — моноклональный продукт. B. Соответствующие результаты фрагментного анализа поликлонального и моноклонального продуктов амплификации

Секвенирование проводили с использованием набора Big Dye Terminator на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности генов сравнивали с последовательностями герминальных V-, D- и J-генов, опубликованных в электронных базах данных (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi и IMGT http://www.imgt.org), и находили нуклеотидную последовательность участка соединения V- D-J-генов — CDR3 участка (рис. 3).

Методика определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 3. Схема подбора пациент-специфичного праймера по генам тяжелой цепи IG (пациент К., 37 лет, В-ОЛЛ). А. Результат фрагментного анализа моноклонального продукта амплификации по генам тяжелой цепи I  G. В. Нуклеотидная последовательность клонального продукта. С. Уникальная для данной клональной реаранжирови CDR3 область. D. Последовательность прямогопациент-специфичного праймера. Е. Консенсусные последовательности обратного праймера и флюоресцентного зонда

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.