text
Портал для медицинских работников

Завершающий этап методики определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

  • 6 декабря 2015
  • 243

Несмотря на определенную трудоемкость, метод позволяет идентифицировать уникальные для каждого пациента реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов и иммуноглобулинов, создать пациент-специфичные праймеры, является высокочувствительным и специфичным.

Построение стандартной кривой, оценка общей и расчетной чувствительности метода

На данном этапе осуществляли построение стандартной кривой и  определение общей и расчетной чувствительности метода. Для этого выполняли серию разведений моноклональной опухолевой ДНК пациента, полученной в дебюте заболевания, в поликлональной смеси ДНК, полученной из мононуклеарных клеток периферической крови как минимум шести здоровых доноров. Условия ПЦР не отличались от таковых на этапе тестирования праймеров. Разведения опухолевой ДНК от 10–1 до 10–5 делали в трех повторах. 

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Согласно разработанному EuroMRD протоколу определения минимальной резидуальной болезни (МРБ), стандартная кривая должна соответствовать следующим критериям:

  • включать в себя как минимум 3 точки разведения;
  • тангенс угла наклона кривой должен иметь значения от -3,1 до -3,9, оптимально от -3,3 до -3,4;
  • коэффициент корреляции должен быть выше 0,98.

Общая чувствительность — наименьшее разведение опухолевой ДНК, определяемое с учетом соответствия следующим критериям:

  • определяет специфический продукт реакции амплификации;
  • хотя бы один из трех повторов дает положительный результат;
  • наибольший пороговый цикл (Ct) в повторах должен быть как минимум на один цикл меньше, чем наименьший Ct поликлонального контроля;
  • разница между наибольшим Ct в повторах и Ct неразведенного образца не должна превышать 20 Ct.

Расчетная чувствительность — наименьшее разведение опухолевой ДНК, определяемое с учетом соответствия следующим критериям:

  • определяет специфический продукт реакции амплификации;
  • разница пороговых циклов в повторах (ΔCt) не превышает 1,5 цикла;
  • наибольший Ct в повторах должен быть как минимум на три цикла меньше, чем наименьший Ct поликлонального контроля;
  • ΔCt разведения должна находиться в диапазоне 2,6–4,0 Ct от ΔCt предыдущего разведения при10-кратном разведении или в диапазоне 0,5–1,5 Ct — при 2-кратном разведении.

В нашем случае для праймера, специфичного для пациента К., 37 лет, с диагнозом В-ОЛЛ, чувствительность метода составила 10–4, расчетная чувствительность — 10–3 (рис. 1).

Завершающий этап методики определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 1. Стандартная кривая, построенная по результатам детекции продуктов амплификации серии разведений моноклональной опухолевой ДНК пациента К., 37 лет, с диагнозом В-ОЛЛ. Общая чувствительность — 10–4, расчетная чувствительность — 10–3

Количественная оценка минимальной резидуальной болезни при использовании ПЦР в реальном времени


Для количественной оценки уровня минимальной остаточной болезни проводилась ПЦР в реальном времени с пациент-специфичным праймером, оценивали уровень МРБ по стандартной кривой и нормировали концентрацию и качество исследуемой ДНК по контрольному гену β-глобина. В реакционной смеси для ПЦР использовали 500 нг ДНК. Для нормирования выполнялась серия разведений ДНК донора, амплификация с праймерами к β-глобину, построение соответствующей стандартной кривой. По положению точки начала цикла амплификации ДНК исследуемого образца на стандартной кривой контрольного гена производилась корректировка качества/количества ДНК.

Для пациента К., 37 лет, с диагнозом В-ОЛЛ исследование ДНК проводили дважды на протяжении болезни. Уровень минимальной остаточной болезни после 36 дней полихимиотерапии находился в пределах расчетной чувствительности и составил 2,80×10–2. Поскольку значение МРБ на  70-й день полихимиотерапии находилось за пределами расчетной чувствительности, но в пределах чувствительности метода, можем говорить о положительном результате МРБ, однако данные о количестве опухолевых клеток отсутствуют (рис. 2).

Завершающий этап методики определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе

Рис. 2. Стандартная кривая, по результатам детекции продуктов амплификации серии разведений моноклональной опухолевой ДНК

Уровень минимальной остаточной болезни на различных этапах терапии впервые выявленных и резистентных форм острого лимфобластного лейкоза, а также после выполнения аллогенной или аутологичной трансплантации стволовых клеток крови имеет принципиальное значение для определения риска развития рецидива и своевременной коррекции тактики ведения больных данным заболеванием.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.