text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Новые подходы к определению антинуклеарных антител при системных аутоиммунных ревматических заболеваниях

  • 1 января 2014
  • 981

В последние годы в практике клинико-диагностических лабораторий широкое распространение получили скрининговые методы определения АНА при помощи ИФА и мультиплексных биоаналитических технологий с использованием планарных и суспензионных микрочипов.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра и цитоплазмы. Семейство АНА включает антитела к ДНК, гистонам, нуклеосомам, экстрагируемым ядерным антигенам (ЭЯА) (Sm, U1РНП, Ro/SSA, La/SSB, Scl-70, Jo-1), ядрышковым антигенам, центромерам и другим клеточным структурам. АНА являются основным лабораторным маркером системных аутоиммунных ревматических заболеваний (САРЗ). Положительные результаты определения АНА входят в число диагностических критериев системной красной волчанки (СКВ), системной склеродермии (ССД), синдрома Шегрена (СШ) , полимиозита/дерматомиозита (ПМ/ДМ), смешанного заболевания соединительной ткани (СЗСТ); применяются для оценки активности, прогноза и идентификации отдельных клинико-лабораторных субтипов этих заболеваний; служат предикторами развития САРЗ у бессимптомных пациентов.

«Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека) (НРИФ–HЕp-2). Применение стандартизованных HEp-2 клеток или варианта этой клеточной линии HEp-2000, имеющего большее количество митозов, позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ). Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального конечного титра обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлуоресценции.

Согласно международным рекомендациям, нормальные титры АНФ в сыворотке крови при использовании НРИФ–HЕp-2 составляют менее 1:160. Указанные нормы АНФ отражают оптимальное соотношение диагностической чувствительности и специфичности метода определения АНА с помощью НРИФ–HЕp-2 и позволяют идентифицировать 95,0% больных САРЗ и 95,0% здоровых лиц. АНФ в титре 1:40 выявляется у 25,0–30,0%, 1:80 –10,0–15,0%, 1:160 и выше – у 5,0% здоровых людей. Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин. Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями имеют титры АНФ ≥1:40 в 25,0–30,0% случаев. Характер ядерного/цитоплазматического свечения при определении АНФ методом НРИФ–HЕp-2 отражает присутствие аутоантиген-специфических АНА, ассоциирующихся с различными САРЗ (табл. 1).

При двухэтапной стратегии иммунодиагностики САРЗ пациентам с положительными результатами обнаружения АНА методом НРИФ–HEp-2 рекомендуется проведение подтверждающих тестов для выявления специфических антител к отдельным ядерным антигенам (двуспиральной (дс) ДНК, ЭЯА) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблота, иммунодота, двойной иммунодиффузии, контриммуноэлектрофореза, радиоиммуноанализа, иммунохемилюминисценции, иммунофлуорометрического анализа и других технологий. В то же время некоторые типы АНА (антитела к центромерам, PCNA, митотическому аппарату клетки, комплексу Гольджи) обнаруживаются только методом НРИФ–HEp-2, что исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью подтверждающих тестов (табл. 1). Выбор спектра подтверждающих тестов при определении аутоантиген-специфических АНА зависит от типа ядерного/цитоплазматического свечения, титров АНА в НРИФ–HЕp-2 и совокупности клинических факторов. Так, при наличии у АНФ-позитивных больных клинических признаков СКВ, рекомендуется тестирование антител к дсДНК. Cтандартными методами определения антител к дсДНК в сыворотке крови служат ИФА, НРИФ с использованием в качестве субстрата Crithidia luciliae и РИА (тест Farr).

Первичным скрининговым тестом для обнаружения антител к дсДНК является метод ИФА. С помощью ИФА определяются как низко-, так и высокоавидные IgG/IgM антитела к дсДНК, что обусловливает меньшую специфичность данного теста по сравнению с другими методами. Большое количество ложноположительных результатов при использовании ИФА может быть вызвано контаминацией дсДНК молекулами односпиральной (ос) ДНК и спонтанной денатурацией дсДНК с образованием осДНК. При положительных результатах определения антител к дсДНК методом ИФА рекомендуется проведение подтверждающих тестов (НРИФ на Crithidia luciliae и РИА Farr), обладающих меньшей чувствительностью, но более высокой специфичностью для диагностики СКВ. В основе метода НРИФ с использованием простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae лежит взаимодействие антител к дсДНК с кинетопластом жгутика, имеющим гигантскую митохондрию, содержащую большое количество кольцевых молекул дсДНК, не ассоциированных с гистоновыми белками. Методом НРИФ выявляются IgG- и IgM-антитела к дсДНК cо средней авидностью. Тест Farr, основанный на преципитации меченной [3H]-ДНК антителами к дсДНК, позволяет измерять высокоавидные антитела к дсДНК. Некоторые разновидности антител к ЭЯА, в частности антитела к SS-A/Ro, рибосомальному белку Р и Jo-1, могут не выявляться методом НРИФ–HЕp-2. При отрицательных результатах определения антител к SS-A/Ro, рибосомальному белку Р и Jo-1 в НРИФ–HЕp-2, но высокой вероятности постановки диагноза СКВ, СШ, неонатальной волчанки, врожденной поперечной блокады сердца или ПМ/ДМ следует использовать альтернативные методы идентификации данных аутоантител (ИФА, иммуноблот и др.).

В последние годы в практике клинико-диагностических лабораторий широкое распространение получили скрининговые методы определения АНА при помощи ИФА и мультиплексных биоаналитических технологий с использованием планарных и суспензионных микрочипов (табл. 2). Такие диагностические платформы автоматизированы, имеют высокую производительность и позволяют одновременно исследовать профиль АНА в небольшом объеме образцов сыворотки крови пациента. Однако, по мнению экспертов EULAR (Европейской антиревматической лиги) и ACR (Американской коллегии ревматологов), новые методы моноплексного и мультиплексного иммунного анализа не могут заменить первичный скрининг АНА с использованием НРИФ–HЕp-2, т. к. идентифицируют антитела к ограниченному количеству очищенных/рекомбинантных антигенов или смеси антигенов (ядерному гомогенату) с измененными либо утраченными эпитопами, что приводит к увеличению процента ложноотрицательных результатов. Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием альтернативных методов твердофазного анализа (ИФА, мультиплексные диагностические системы), должны предоставить данные о такой же или более высокой чувствительности и специфичности этих технологий по сравнению с НРИФ–HЕp-2, а при расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными обязательно провести повторное исследование АНА методом НРИФ–HЕp-2.

Следует отметить, что рутинная технология флуоресцентной микроскопии имеет ряд ограничений, к которым относятся различия используемых методик (тип микроскопа, используемые тест-системы и реагенты, время инкубации и др.), субъективизм исследователя при оценке титра и типа свечения АНФ, необходимость длительного обучения персонала, отсутствие квалифицированной экспертной оценки результатов исследования, что приводит к значительной внутри- и межлабораторной вариабельности полученных данных.

Разработка автоматизированных систем интерпретации клеточных флуоресцентных тестов создает предпосылки для стандартизации и улучшения воспроизводимости НРИФ–HЕp-2 при определении АНА у больных САРЗ. Среди готовых технологических платформ, осуществляющих анализ АНА путем автоматической визуализации и объективного распознавания образцов флуоресценции, одни аналитические системы проводят только скрининг положительных и отрицательных результатов НРИФ–HЕp-2 (Helios, Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germany; Image Navigator, Immuno Concept, Sacramento, USA; Cytospot, Autoimmun Diagnostika, Straβberg, Germany), в то время как другие способны также классифицировать основные типы свечения клеточных структур (AKLIDES, Medipan, Dahlewitz/Berlin, Germany; Nova View Inova, San Diego, USA; Zenit G Sight, A. Menarini Diagnostics, Grassina-Firenze, Italy; Europattern, Euroimmun, Lubeck, Germany).

Нами было проведено исследование АНА в сыворотке крови у 1178 больных (185 больных СКВ, 148 – СШ, 181 – ССД, 44 – ПМ/ДМ, 60 – перекрестным синдромом, 35 – антифосфолипидным синдромом, 525 – другими РЗ), наблюдавшихся в ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН в течение 2012 г.

АНА определяли методом НРИФ–НЕр-2 с помощью набора реагентов AKLIDES®ANA («Medipan GmbH», Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Обработку результатов НРИФ–HЕp-2 проводили с использованием автоматизированной платформы AKLIDES («Medipan GmbH», Германия) на основе многопараметрического анализа внутриклеточных структур и путем визуальной оценки образцов флуоресценции под микроскопом AXIOSKOP 40 («Zeiss», Германия). Для измерения степени согласованности  автоматизированной и визуальной интерпретации результатов определения АНА применялся коэффициент каппа (κ) Коэна. Согласованность результатов оценивалась как «слабая» (κ<0,4),  «хорошая» (0,4< κ≤0,75) и «высокая» (κ >0,75).

Степень согласованности позитивных/негативных результатов обнаружения (κ=0,5) типов (κ=0,7) и титров/интенсивности свечения (κ=0,45) АНА при автоматизированной и традиционной интерпретации НРИФ–HEp-2 являлась «хорошей». Несовпадение позитивных/негативных результатов исследования АНА, по данным автоматизированного и визуального методов оценки НРИФ–HEp-2, отмечалось у 18,5% пациентов. Автоматизированным методом наиболее часто определялось гомогенное (37,6%) и крапчатое (32,3%) свечение ядра; у 21,4% больных тип свечения не дифференцировался. Визуальным методом в сыворотках крови большинства пациентов (72,8%) выявлялся смешанный тип свечения. Смешанное свечение распознавалось системой AKLIDES как гомогенное – у 40,5% больных, крапчатое – 32,7%, нуклеолярное – 2,4%, центромерное – 0,9%, недифференцированное – у 23,5% больных. При визуальном исследовании образцов флуоресценции с недифференцированным типом свечения, в 79,8% случаев было идентифицировано смешанное, 5,9% – гомогенное, 14,3% – крапчатое свечение. Титры АНА менее 1:160 ассоциировались с интенсивностью свечения «0»/«±»; 1:160 – «0», «±», «+», «++»; 1:320 – «+», «++»; 1:640 – «++», «+++»; ≥ 1:1280 – «+++», «++++».

Полученные результаты подтверждают данные литературы о хорошей согласованности автоматизированной и визуальной интерпретации НРИФ–HEp-2 при исследовании АНА в сыворотке крови больных САРЗ. Позитивные/негативные результаты определения АНФ рутинным методом и на анализаторе AKLIDES совпадали у 81,5% больных РЗ (κ=0,5). В работах других авторов согласованность позитивных/негативных результатов выявления АНА, по данным автоматизированной и визуальной оценки НРИФ–HEp-2, достигала 90,0–99,4% (κ=0,554-0,984). В целом в группе обследованных нами больных РЗ (n=1178) чувствительность определения АНА с помощью автоматизированной платформы AKLIDES была выше, чем при использовании визуальной микроскопической техники (80,0 и 71,6%, соответственно, p<0,05). Возможными причинами несовпадения результатов автоматизированной и визуальной идентификации позитивности/негативности ядерного свечения являются расхождения в оценке отрицательных/низких титров АНФ и интенсивности сигнала флуоресценции; учет цитоплазматического свечения системой AKLIDES; артефакты, связанные с некачественной окраской препаратов.

Одной из важных проблем автоматизированной оценки характера ядерного свечения при определении АНА методом НРИФ–HEp-2 является трудность дифференцировки гомогенного типа свечения от различных форм мелкого диффузного крапчатого свечения ядра и цитоплазмы клетки. Другим сложным аспектом автоматизированной обработки результатов клеточных флуоресцентных тестов является распознавание смешанного свечения при сочетании в одном АНФ-позитивном образце сыворотки крови больного четырех–пяти различных типов флуоресценции за счет аутоантител, реагирующих с множеством ядерных антигенов. В нашей работе автоматизированная система AKLIDES идентифицировала, в основном, гомогенное (37,6%) и крапчатое (32,3%) свечение, однако в 21,4% случаев регистрировала недифференцированный тип свечения, который у 79,8% больных РЗ распознавался визуальным методом как смешанный. После исключения из анализа недифференцированного и смешанного свечения, совпадение по типам флуоресценции при автоматизированной и визуальной интерпретации положительных результатов НРИФ–HEp-2 составляло 80,0% (κ=0,7). Расхождения в интерпретации типов ядерного свечения при автоматизированной и визуальной обработке результатов НРИФ–HEp-2 могут быть связаны с комбинацией различных типов свечения в одном образце (смешанное свечение), наличием редких типов свечения (антител к ядерной мембране, комплексу Гольджи и др.), титрами АНФ. В связи с этим рекомендуется проведение дополнительного визуального исследования АНА-позитивных образцов флюоресценции для уточнения и классификации типов ядерного свечения.

Полученные результаты подтверждают данные литературы о хорошей согласованности титров АНА с интенсивностью флюоресценции, оцениваемой системой AKLIDES.

В рутинной практике автоматизированная платформа AKLIDES и другие автоматизированные системы интерпретации клеточных флуоресцентных тестов позволяют осуществлять эффективный объективный скрининг позитивных и негативных результатов определения АНА методом НРИФ–HEp-2, а также прогнозировать максимальный конечный титр АНА в сыворотках крови больных САРЗ по интенсивности сигнала флюоресценции. Для подтверждения результатов автоматизированной оценки типов ядерного свечения и уточнения титров АНА рекомендуется дополнительное экспертное визуальное исследование позитивных образцов флуоресценции.

Таблица 1

Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 

Тип свечения

Аутоантигены

Заболевания

Частые типы свечения

Ядерное свечение

Гомогенное

Двуспиральная ДНК, гистоны, хроматин/нуклеосомы, HMG (high mobility group)

СКВ, лекарственная волчанка/васкулиты, ювенильный идиопати-ческий артрит

Крупное крапчатое

Sm, U1-рибонуклео-протеин, ядерный матрикс

СКВ, СЗСТ, синдром Рейно, ССД, СШ, недифферен-цированное заболевание соединительной ткани

Мелкое крапчатое

SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, многие ядерные антигены

СКВ, СШ, ССД, воспалительные миопатии, СЗСТ

Центромерное

Кинетохор: CENP-A, B, C, F

 ССД (лимитированная форма), синдром Рейно

Нуклеолярное

PM/Scl, РНК-полимераза, U- рибонуклеопротеин, U3- рибонуклеопротеин, To/Th, B23, фосфопротеин/нуматрин

ССД, синдром Рейно, воспалительные миопатии, перекрестный синдром

Цитоплазматическое свечение

Диффузное

Рибосомальный белок Р, Jo-1, другие синтетазы трансферной РНК, частицы сигнального распознавания (SRP)

СКВ, воспалительные миопатии

Мелкое крапчатое

Jo-1, SRP, пируватдегидрогеназа (PDH) (митохондрии)

Воспалительные миопатии, ДМ, ПБЦ, интерстициальное поражение легких

Редкие типы свечения

Ядерное свечение

Периферическое/краевое или оболочки ядра

Ламинины, LAP1/2gp210, нуклеопорин р62, комплексные антигены ядерной оболочки и ядерных пор

СКВ, РА,  ПБЦ, воспалительные миопатии, аутоиммунные заболевания печени

Плотное мелкое крапчатое

DFS70/LEDGF-P75

Здоровые лица, воспали-тельные заболевания

Плейоморфное крапчатое клеточного цикла (PCNA)

Вспомогательный белок ядерного антигена клеточной пролиферации: фактор элонгации ДНК-полимеразы дельта

СКВ, лимфопролиферативные заболевания, СШ

Нуклеолярное (глыбчатое)

U3-рибонуклеопротеин (фибриллярин)

ССД

Множественное/редкое точечное

Sp100, PML-тельца, p80-coilin

ПБЦ, ХАГ, СШ

Центросомы/центриоли (ранее: аппарат веретена )

Энолаза, нинеин, перицентрин

ССД, синдром Рейно, воспалительные заболевания

Митотическое веретено

NuMa/центрофилин

РА, воспалительные заболевания, микоплазменная пневмония

Цитоплазматическое свечение

Дискретное крапчатое

Эндосома (ранний эндосомальный антиген-1), глицин-триптофан (GW)/процессирующие тельца, мультивезикулярные тельца/лизосомы

Неврологические заболевания, СШ, СКВ, РА, ПБЦ, недифференцированные заболевания соединительной ткани

Комплекс Гольджи

Белки Гольджи/гольджины: гиантин, гольджин 245, гольджин 110, гольджин 97, гольджин 95 и др.

СКВ, СШ, РА, перекрестный синдром, мозжечковая атаксия

Цитоплазматические волокна

Актин, цитокератин, топомиозин, виментин

ХАГ, ДМ, инфекционные и воспалительные заболевания

Примечание: Системная красная волчанка – СКВ, смешанное заболевание соединительной ткани - СЗСТ, системная склеродермия - ССД, синдром Шегрена - СШ, дерматомиозит - ДМ, первичный билиарный цирроз - ПБЦ, ревматоидный артрит - РА, хронический аутоиммунный гепатит – ХАГ.

Таблица 2

Мультиплексные тест-системы, используемые для определения АНА в сыворотке крови при системных аутоиммунных ревматических заболеваниях

Тип микрочипов

Количество ядерных антигенов

INNO-LIA ANA (планарные микрочипы, линейный иммуноблот) («Innogenetics»)

12

INNO-LIA ANA Update (планарные микрочипы, линейный иммуноблот) («Innogenetics»)

13

RecombLine ANA/ENA (планарные микрочипы, линейный иммуноблот) («Mikrogen»)

14

ANA-LIA (планарные микрочипы, линейный иммуноблот) («Imtec»)

11

QuantaPlex (технология хMAP) («Inova Diagnostics»)

8

AtheNA Multi-Lyte (технология хMAP) («Zeus Diagnostics»)

10

FIDIS (технология хMAP) («Biomedical Diagnostics»)

9

BioPlex 2200 (технология хMAP) («Bio-Rad Laboratories»)

13

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.