Диагностическая характеристика иммуноферментных тест-систем для выявления Treponema pallidum

157

Существенными преимуществами иммуноферментных тест-систем являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения скрининговых исследований, получение результата в течение короткого промежутка времени и автоматический его учет.

В настоящее время диагностика сифилиса базируется либо на обнаружении возбудителя T. pallidum в экссудатах, жидкостях и тканях организма, либо на выявлении антител к микроорганизму. Тесты для диагностики сифилиса можно разделить на две категории: нетрепонемные (НТ), выявляющие антитела к кардиолипину; и трепонемные (ТТ), выявляющие антитела к специфическим антигенам T. рallidum.

В качестве НТ применяют следующие тесты: реакция связывания комплемента (РСК), микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МРП) с плазмой или инактивированной сывороткой, тест быстрых плазменных реагинов (RPR), тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (TRUST), тест отбора реагинов (RST).

НТ широко доступны, быстры, недороги и крайне необходимы для определения эффективности лечения заболевания или подтверждения реинфекции. К существенным недостаткам таких тестов следует отнести низкую чувствительность на ранних и поздних стадиях заболевания, наличие эффекта прозоны, а также достаточно большое количество ложноположительных результатов.

Для ТТ применяют различные методы, включая гемагглютинацию, иммуноферментный анализ (ИФА), иммунофлуоресценцию, иммуноблот и иммунохроматографию. К неоспоримым достоинствам ТТ следует отнести высокий показатель чувствительности и специфичности, хотя, по данным различных лабораторий, в 1,5–3,1% случаев возможно получение ложноположительных результатов за счет перекрестно реагирующих с трепонемными антигенами антител, образующихся при различных системных или индуцированных лекарственными средствами и наркотиками нарушениях обмена веществ.

Для успешной постановки диагноза необходима тест-система, обладающая высокой диагностической чувствительностью и специфичностью на любой стадии заболевания (в т. ч. при повторном инфицировании). К сожалению, на сегодняшний день не существует единого теста, который бы удовлетворял всем перечисленным требованиям, поэтому для диагностики сифилиса используют комбинации различных тестов. Диагностика сифилиса в медицинских учреждениях проводится в соответствии с приказом Минздрава России от 26.03.2001 № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».

В клинической лабораторной практике существует два алгоритма для диагностики сифилиса, каждый из которых имеет ряд преимуществ и недостатков. Традиционно исследование начинается с НТ и в случае позитивного результата в качестве подтверждающего теста используют ТТ. Такой алгоритм является рентабельным для небольших диагностических лабораторий, а результаты тестирования довольно хорошо коррелируют с клиническими проявлениями заболевания. Однако данная схема диагностики имеет существенные ограничения при использовании в масштабных скрининговых исследованиях – из-за недостаточной чувствительности и специфичности тестов, ручной процедуры анализа и субъективного учета результатов. В связи с этим многие клинические лаборатории в различных странах Европы и в США используют альтернативный, т. н. обратный скрининг («revers») для диагностики сифилиса. При таком подходе образцы сывороток сначала тестируют при помощи ТТ, а затем положительные результаты выявления антител подтверждают с использованием НТ. Данный алгоритм имеет свои преимущества, в т. ч. возможность автоматизации процесса и объективный учет результатов, а также способность выявлять раннюю и позднюю / латентную стадии сифилиса.

На первом этапе обратного скрининга чаще применяют иммуноферментные тест-системы, при изготовлении которых используют рекомбинантные аналоги наиболее иммуногенных липопротеинов T. pallidum – р15, р17, р41, р47. Белок р17 вызывает наиболее активную продукцию специфических антител, особенно на стадии вторичного сифилиса. Кроме того, антитела к этому белку обнаруживают при скрытых формах сифилиса. Антитела к белкам р15 и р47 позволяют диагностировать первичный и врожденный сифилис. Белок р41 значительно повышает чувствительность исследования, антитела к нему обнаруживают на стадии первичного сифилиса при общем довольно низком уровне антител к белкам возбудителя. Кроме того, титр антител к этому белку снижается при адекватной терапии, что может быть использовано для мониторинга эффективности лечения.

 Существенными преимуществами иммуноферментных тест-систем являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения скрининговых исследований, получение результата в течение короткого промежутка времени и автоматический его учет, отсутствие необходимости в сложном оборудовании и предварительной обработке тестируемого материала. Использование таких тестов в рутинной лабораторной практике является одним из основных направлений при проведении мероприятий, предупреждающих рост заболеваемости и распространение сифилиса, особенно при переливании крови.

Была исследована сыворотка или плазма крови пациентов районных кожно-венерологических диспансеров г. Киева с подозрением на сифилис или с подтвержденным диагнозом сифилиса на разных стадиях заболевания. Контингент обследованных пациентов включал:

  • 533 чел. без подтвержденного диагноза сифилиса;
  • 95 больных первичным сифилисом;
  • 28 больных первичным сифилисом с отрицательным результатом стандартных НТ;
  • 225 больных рецидивирующим сифилисом;
  • 137 больных вторичным сифилисом;
  • 127 больных вторичным скрытым сифилисом;
  • 45 пациентов, контактировавших с больным сифилисом и прошедших курс профилактической терапии;
  • 125 больных сифилисом после курса терапии, проведенной в стационаре;
  • 17 детей с подтвержденным диагнозом врожденного сифилиса;
  • 1576 здоровых доноров.

При исследовании использовали:

  • панель сывороток / плазмы крови «Mixed Titer Performance Panel PSS201» производства Boston Biomedica Inc. (USA), состоящую из 25 образцов, из которых 2 отрицательных, 23 содержат IgG и 9 – IgM к T. pallidum;
  • НТ: реакция Вассермана (РВ), МРП и ее аналог – ускоренный плазмареагиновый тест (RPR, rapid plasma reagin test);
  • ТТ: ИФА, для проведения которого использовали диагностические иммуноферментные тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep», «DIA-SYPH», «DIA-IgM-SYPH» производства ЧАО НПК «Диапроф Мед» и «Trepanostika» (Organon Teknika, Netherlands).

Тест-система «DIA-IgG-IgM-Trep» сконструирована в формате твердофазного двухэтапного непрямого ИФА. В состав иммуносорбента входят рекомбинантные белки – аналоги антигенов T. pallidum (р15, р17, р41 и р47). Иммунные комплексы выявляются пероксидазным конъюгатом на основе моноклональных антител к IgG и IgM человека.

Тест-система «DIA-SYPH» изготовлена в одноэтапном «сендвич»-варианте с использованием рекомбинантных антигенов р17 и р47 в составе иммуносорбента и пероксидазного конъюгата. Выявляет суммарные антитела к T. pallidum.

Тест-система «DIA-IgM-SYPH» предназначена для определения IgM к T. pallidum. Сконструирована в формате IgM-«захвата». В составе иммуносорбента использованы мышиные моноклональные антитела к IgM человека. Специфические антитела выявляются рекомбинантными антигенами р17, р47 и р41, конъюгированными с пероксидазой хрена.

Тест-система «Trepanostika» изготовлена в формате конкурентного ИФА и предназначена для определения суммарных специфических антител к T. pallidum. В состав иммуносорбента входят лизатные оболочечные белки T. pallidum. Конъюгат – антитрепонемная сыворотка человека, меченная пероксидазой хрена. В одноэтапной реакции специфические антитела исследуемой сыворотки конкурируют с антителами конъюгата за сайты связывания со специфическими антигенами в составе иммуносорбента.

Определение специфических IgM входит в алгоритм обследования пациентов при постановке диагноза первичного и раннего врожденного сифилиса, активной рецидивирующей инфекции, а также при определении эффективности проводимой терапии. Однако при диагностике специфических IgM существует большая вероятность получения ложноположительных результатов. Одной из причин их появления может быть наличие при системных заболеваниях ревматоидного фактора и IgM, перекрестно реагирующих с антигенами T. pallidum, а также появление иммуноглобулинов класса М у новорожденных к IgG матери. Нами разработана тест-система «DIA-IgM-SYPH» для определения IgM к T. pallidum, конструкция которой в варианте IgM-«захвата» обеспечивает ей высокую специфичность, поскольку IgM к T. pallidum выявляются мечеными рекомбинантными белками – аналогами антигенов возбудителя сифилиса.

Снижение IgM в течение 6–12 мес. после инфицирования бледной трепонемой в ходе вторичного периода сифилиса и их отсутствие при латентной форме заболевания сопровождаются персистенцией в организме специфических IgG. Вместе с тем, недостаточная чувствительность тест-систем может быть причиной ложноотрицательных результатов. Разработанные нами тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep» и «DIA-SYPH» позволяют выявлять суммарные антитела к T. pallidum. При проведении анализа с использованием тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep» специфические антитела, связанные с антигенами иммуносорбента, выявляются моноклональными антителами к IgM и IgG человека в составе конъюгата. Набор реагентов «DIA-SYPH» сконструирован в «сендвич»-варианте, и суммарные специфические антитела связываются с рекомбинантными белками иммуносорбента и конъюгата.

Результаты исследования чувствительности и специфичности разработанных тест-систем с использованием панели сывороток / плазмы крови PSS201 (BBI) представлены в табл. 1. Кроме результатов, полученных методом ИФА, в таблице приведены (из паспортных данных панели) результаты тестирования этих образцов другими методами – RPR и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) – FTA-ABS. Тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep» и «DIA-SYPH» выявляли специфические антитела во всех положительных образцах панели. При этом «DIA-SYPH» диагностировал их с более высоким соотношением «оптическая плотность (ОП) / cut off» (р < 0,05). В двух отрицательных сыворотках панели тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep» и «DIA-SYPH» не выявили специфические антитела. При использовании «DIA-IgM-SYPH» выявлены специфические IgM в 8 образцах панели, тестирование которых показало положительные результаты при использовании тестов RPR и FTA-ABS.

Таблица 1

Результаты исследования панели сывороток / плазмы крови PSS201 (BBI)

Номер образца панели

Результат анализа, название тест-системы

Bect.-Dick.

RPR

(титр)

Wampole

RPR

(титр)

Zeus

FTA-ABS

(результат)

DIA-IgG-IgM-Trep

(ОП/cut off)*

DIA-SYPH

(ОП/cut off)

DIA-IgM-SYPH

(ОП/cut off)

PSS201-01

8

32

Положит.

9,2

17,8

3,4

PSS201-02

2

8

Положит.

10,9

19,4

1,4

PSS201-03

Отр.

Отр.

Положит.

11,1

19,9

0,2

PSS201-04

Отр.

Отр.

Положит.

10,9

19,8

1,7

PSS201-05

Отр.

Отр.

Отр.

0,5

0,3

0,1

PSS201-06

16

64

Положит.

9,6

19,9

5,4

PSS201-07

1

2

Положит.

10,5

20,0

0,6

PSS201-08

4

8

Положит.

11,6

21,3

0,2

PSS201-09

1

4

Положит.

10,2

23,0

0,4

PSS201-10

4

16

Положит.

12,2

20,9

0,5

PSS201-11

1

4

Положит.

12,1

22,1

0,4

PSS201-12

Отр.

Отр.

Положит.

8,9

21,4

0,3

PSS201-13

4

8

Положит.

10,3

20,7

0,4

PSS201-14

Отр.

Отр.

Положит.

10,4

20,9

0,2

PSS201-15

Отр.

Отр.

Отр.

0,4

0,3

0,1

PSS201-16

8

32

Положит.

12,7

22,0

1,7

PSS201-17

16

64

Положит.

13,3

22,0

3,6

PSS201-18

8

32

Положит.

12,6

21,6

0,3

PSS201-19

4

2

Положит.

11,3

20,3

0,2

PSS201-20

1

2

Положит.

10,3

21,2

0,2

PSS201-21

8

32

Положит.

8,6

17,6

5,6

PSS201-22

Отр.

Отр.

Положит.

9,6

20,3

0,6

PSS201-23

1

2

Положит.

11,7

20,6

0,3

PSS201-24

1

4

Положит.

11,5

21,8

0,5

PSS201-25

8

128

Положит.

7,3

14,3

6,8

* При соотношении ОП / cut off больше 1,0 – результат положительный, меньше 1,0 – результат отрицательный.

Способность тест-систем разных конструкций выявлять антитела к T. pallidum исследована при анализе сывороток крови больных сифилисом, которым предварительно проведена РВ, на разных клинических стадиях – первичный, вторичный и скрытый сифилис (табл. 2). При исследовании с использованием тест-системы «DIA-SYPH» положительные результаты выявления антител к T. pallidum были получены для всех 215 образцов крови, взятых у больных на всех стадиях инфекционного процесса. При использовании тест-системы «DIA-IgG-IgM-Trep» для 2 из 28 сывороток крови больных первичным сифилисом (результат РВ – отрицательный) результат анализа получен в пределах «серой зоны» (на 10,0% меньше значения cut off). При использовании набора «DIA-IgM-SYPH» специфические IgМ чаще обнаруживали у больных первичным и вторичным сифилисом, у больных с латентным протеканием заболевания они отсутствовали, что соответствует особенностям сероконверсии при сифилисе и согласуется с данными литературы. При исследовании данным набором реагентов 17 сывороток крови новорожденных с подтвержденным диагнозом врожденного сифилиса специфические IgM выявлены во всех образцах.

Таблица 2

Результаты исследования сыворотки крови больных сифилисом на разных стадиях заболевания

Диагноз

Количество исследованных образцов

DIA-IgG-IgM-Trep

DIA-SYPH

DIA-IgM-SYPH

количество положительных результатов

Первичный сифилис (РВ отрицательная)

28

26

28

25

Первичный сифилис (РВ положительная)

27

27

27

25

Вторичный сифилис

137

137

137

73

Скрытый сифилис

23

23

23

2

В табл. 3 представлены результаты исследования сывороток крови 1100 пациентов кожно-венерологических диспансеров с использованием НТ (РВ и МРП) и «DIA-IgG-IgM-Trep». При анализе 533 сывороток крови пациентов без окончательного диагноза положительные результаты при применении РВ получены для 186 образцов (34,0%), МРП – 210 (39,4%), ИФА – 234 (43,9%). При тестировании сывороток крови 68 больных с первичным сифилисом РВ выявила специфические антитела в 61 образце (89,7%), МРП и ИФА определили специфические антитела у всех пациентов. При исследовании сывороток крови больных с рецидивирующим сифилисом (225 чел.) положительные результаты при применении РВ получены для 216 образцов (96,0%), при использовании МРП и ИФА специфические антитела выявлены во всех сыворотках.

При исследовании крови 104 больных вторичным скрытым сифилисом, наибольшую диагностическую чувствительность продемонстрировала тест-система «DIA-IgG-IgM-Trep», при использовании которой специфические антитела обнаружены у 99 пациентов (95,2%), тогда как при применении РВ – у 95 пациентов (91,3%), МРП – у 97 пациентов (93,3%).

Таблица 3

Результаты выявления специфических антител к Т. pallidum при использовании разных наборов реагентов и методов

Контингент больных

Количество исследованных образцов

Тесты

реакция Вассермана

реакция микро-
преципитации

«DIA-IgG-IgM-Trep» ИФА

количество положительных результатов (%)

Пациенты без окончательного диагноза

533

186

(34,0%)

210

(39,4%)

234

(43,9%)

Больные первичным сифилисом

68

61

(89,7%)

68

(100,0%)

68

(100,0%)

Больные рецидивирующим сифилисом

225

216

(96,0%)

225

(100,0%)

225

(100,0%)

Больные вторичным скрытым сифилисом

104

95

(91,3%)

97

(93,3%)

99

(95,2%)

Пациенты, контактирующие с больным сифилисом и прошедшие курс профилактической терапии

45

8

(17,8%)

12

(26,7%)

10

(22,2%)

Больные сифилисом после курса терапии в стационаре

125

39

(31,2%)

81

(64,8%)

109

(87,2%)

Всего больных

1100

605

(55,0%)

693

(63,0%)

745

(67,7%)

 Среди пациентов, которые контактировали с больным сифилисом и прошли курс профилактической терапии, у 8 чел. (17,8%) получены положительные результаты выявления специфических антител при применении РВ, у 12 чел. (26,7%) – МРП и 10 чел. (22,2%) – ИФА. При повторном исследовании с использованием МРП двух сывороток крови, результат тестирования которых не совпадал с данными, полученными методом ИФА, получен отрицательный результат.

В наибольшей степени отличались результаты исследования различными методами сывороток крови больных сифилисом, прошедших курс лечения в стационаре. Из 125 больных положительные результаты при использовании РВ получены для 39 образцов сыворотки крови (31,2%), МРП – 81 (64,8%), «DIA-IgG-IgM-Trep» – 109 (87,2%). Все сыворотки крови, при тестировании которых разными методами результаты отличались, были повторно исследованы методами РВ, МРП, ИФА с использованием тест-систем «DIA-IgG-IgM-Trep» и «Trepanostika» (табл. 4). Согласно полученным данным, расхождение результатов тестирования отмечено только при исследовании образцов от больных с вторичным скрытым сифилисом. Из 9 сывороток крови при использовании «DIA-IgG-IgM-Trep» выявлены специфические антитела в 5 образцах, а «Trepanostika» – только в 4 образцах. Остальные результаты анализа сывороток крови, полученные при использовании указанных наборов реагентов, совпали.

Таблица 4

Результаты повторного исследования сывороток крови, при первичном тестировании которых получены несовпадающие данные

Контингент больных

Количество исследованных образцов

Тесты

реакция Вассермана

реакция микро-
преципитации

иммуноферментный анализ

«DIA-IgG-IgM-Trep»

«Trepanostika»

количество положительных результатов

Больные с первичным сифилисом

7

0

7

7

7

Больные с рецидивирующим сифилисом

9

0

9

9

9

Больные с вторичным скрытым сифилисом

9

0

2

5

4

Пациенты, контактирующие с больным сифилисом, после курса профилактической терапии

4

0

4

2

2

Больные сифилисом после курса терапии в стационаре

96

0

54

96

96

По данным многих авторов, у переболевших сифилисом возбудитель инфекции часто сохраняется в лимфатических узлах в форме цист, наличие которых в организме приводит к продукции специфических антител. При переходе цист в L-форму с менее выраженной антигенной структурой синтез специфических антител резко снижается либо совсем прекращается. При исследовании сывороток крови таких больных методами РВ и МРП результат анализа, как правило, отрицательный. При исследовании подобных сывороток методом ИФА результат может быть положительным, поскольку чувствительность и специфичность выше, что обусловлено участием в реакции рекомбинантных белков – более специфичных и иммуногенных аналогов антигенов T. pallidum. Полученные нами данные подтвердили высокую способность иммуноферментных тест-систем выявлять скрытую и недолеченную форму сифилиса по сравнению с методами РВ и МРП.

При исследовании 1576 сывороток крови здоровых доноров с использованием тест-систем «DIA-IgG-IgM-Trep», «DIA-SYPH» и «DIA-IgM-SYPH» ложноположительные результаты отсутствовали.

Таким образом, проведенное исследование показало высокую чувствительность и специфичность тест-систем «DIA-IgG-IgM-Trep», «DIA-SYPH» и «DIA-IgM-SYPH», что позволяет рекомендовать их к широкому использованию в лабораторной практике вместо более трудоемких тестов при проведении как скрининговых исследований донорской крови, так и при контроле эффективности проводимой терапии. 

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×