Перестройки гена ALK при немелкоклеточном раке легких

Активация гена ALK при его перестройках происходит в результате образования химерных генов, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма.

Роль транслокаций – перемещений генетического материала между генами, ведущих к формированию химерных структур, – в онкогенезе известна достаточно давно. Из 384 генов, являющихся доказанными участниками опухолевой трансформации, по данным Сангеровского института, как минимум 282 участвуют в реаранжировках при самых разнообразных опухолях [1]. Надо отметить, что в течение длительного времени транслокации считались более характерными для опухолей кроветворной системы и сарком, чем для новообразований эпителиоидной природы. В первую очередь это было связано с ограниченными возможностями существовавших цитогенетических методик. В последние годы, благодаря применению современных молекулярно-генетических методов, доказано, что хромосомные перестройки не только являются нередким событием при солидных опухолях, но и зачастую играют ведущую роль в их развитии и прогрессии [2, 3].

Обнаружение внутрихромосомной перестройки короткого плеча 2 хромосомы, что приводит к образованию химерного онкогена EML4/ALK при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), стало одним из важнейших шагов в расшифровке генома этого заболевания и расширении возможностей персонализации его лечения (рис.1). Исследования Soda и соавт., опубликованные в 2007 г. в журнале Nature, показали ведущую роль этого генетического нарушения в онкогенезе для небольшой подгруппы аденокарцином легких и предположили возможность блокирования химерного протеина с помощью ингибиторов тирозинкиназ [4].

Рисунок 1. Образование химерного онкогена EML4/ALK (по Thunissen E et al. Virchows Arch 2012)

Активация гена ALK при его перестройках происходит в результате образования химерных генов, в котором участвуют тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма. В такой ситуации ALK попадает под воздействие второго участника транслокации, становится независимым от своих лигандов и передает сигнал постоянно, нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки [5]. Так происходит при всех опухолях, в генезе которых принимает участие перестроенный ген: при анапластической Т-клеточной лимфоме, воспалительной миофибробластической опухоли, некоторых опухолях нервной системы, редких случаях плоскоклеточного рака пищевода и т. д. [6].

При НМРЛ наиболее часто выявляется химерный ген EML4/ALK. Его образование происходит в результате делеции, возникающей в коротком плече 2 хромосомы, и поворота 5’ части ближайшего соседа ALK, гена EML4, вокруг своей оси [4]. Таким образом, ALK попадает под влияние регулирующих последовательностей EML4 (рис. 2) и переходит в активное состояние. Как правило, в формировании транскрипта химерного гена участвует 20 (редко – 19) экзон ALK. Точка разрыва EML4 гораздо разнообразнее – описано как минимум 11 видов химерного транскрипта в зависимости от экзона этого гена, принимающего участие в его формировании [7].

Рисунок 2. Различные виды химерных транскриптов с участием гена ALK. (по Sasaki T etal, Eur J Oncol 2010). 

Доказано, что все виды EML4/ALK обладают одинаково выраженным онкогенным потенциалом, однако чувствительность различных видов химерного протеина к блокаторам тирозинкиназ может быть различной. Такие данные были получены при исследованиях in vitro, подтверждения этому in vivo пока нет [8]. Известны также другие гены-партнеры ALK: KIF5B, TGF, KLC1. Частота таких транслокаций невелика и составляет не более 10,0%.

Одним из путей блокирования активированных тирозинкиназ является использование малых молекул-ингибиторов, структура которых подбирается таким образом, чтобы как можно эффективнее заблокировать ту часть протеина, которая участвует в связывании энергетической молекулы, и прекратить передачу сигнала [9]. Таким образом работают ингибиторы химерного протеина BCR-ABL при хроническом миелолейкозе и мутантного белка EGFR при НМРЛ. При перестройках гена ALK высокую эффективность показал кризотиниб – препарат, который разрабатывался как сочетанный блокатор протеинов MET и ALK. Уже в экспериментах in vitro было обнаружено, что его минимальные ингибирующие концентрации, вызывающие апоптоз клеток, экспрессирующих EML4/ALK, очень низки, что позволило быстро перейти от доклинических испытаний к клиническим и подтвердить выраженное противоопухолевое действие препарата. Полученные результаты позволили провести процедуру быстрой регистрации препарата для клинического использования в Федеральном управлении по контролю над продуктами и лекарствами США (FDA), не дожидаясь результатов III фазы исследований [10].

Демографические и клинико-лабораторные характеристики пациентов с перестройкой гена ALK

Известен ряд признаков, ассоциирующихся, по данным ранее проведенных исследований, с высокой частотой встречаемости перестроек гена ALK. В первую очередь, имеет значение гистологическая форма опухоли. Практически все случаи реаранжировки гена ALK обнаружены у больных с аденокарциномой, хотя встречаются единичные сообщения о выявлении перестроек в опухолях с гистологическими признаками плоскоклеточного рака [11]. Более чем в 50,0% реаранжированных случаев обнаруживается преимущественно солидная или ацинарная структура опухоли, гораздо реже – чешуйчатая, и крайне редко – муцинозная форма аденокарциномы. В 70,0–75,0% случаев выявляется присутствие перстневидных клеток. В целом, частота встречаемости перестроек ALK при всех формах аденокарцином составляет от 3,0 до 14,0% в зависимости от особенностей выборки [13]. Такие существенные различия связаны, в первую очередь, с фактором, влияющим на частоту встречаемости транслокаций ALK при НМРЛ, – курением. Около 56,0% реаранжировок встречается у некурящих пациентов с НМРЛ [14]. Согласно опубликованным данным, частота выявления перестроек ALK у некурящих больных НМРЛ составляет от 13,7 до 20,0% [15, 16]. Другими факторами, влияющими на частоту встречаемости этого генетического нарушения, являются молодой возраст больных и отсутствие конкурентных генетических нарушений, таких как мутации генов EGFR и KRAS. Селекция выборки по всем упомянутым критериям позволяет увеличить возможность выявления транслокаций ALK до 45,0%, однако ценой такой селекции будет потеря почти 50,0% пациентов с перестройками исследуемого гена, которые попадут в исключенные из исследования группы [17]. В связи с этим общепринятым подходом к выбору пациентов, направляемых на определение перестроек гена ALK, является отбор больных с гистологически доказанной аденокарциномой. Правомерность такого подхода подтверждается не только результатами клинических исследований, но и фармакоэкономическими расчетами [15].

Методы, используемые для обнаружения реаранжировок ALK

Общепризнанным методом выявления перестроек гена ALK является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Наиболее широко используется рекомендованная FDA методика с использованием набора LSI ALK Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular, США) [18]. Набор представляет собой два флуоресцентных зонда, конъюгированных с красителями разного цвета (оранжевым и зеленым) и комплементарных расположенным рядом последовательностям гена ALK. В норме оба зонда гибридизуются рядом и формируют сигнал желтого цвета или расположенные вплотную два сигнала красного и зеленого цвета, которые оценивают при применении флуоресцентного микроскопа. При перестройке гена и перемещении одной из его последовательностей сигналы расходятся и видны как лежащие раздельно. Такая методика позволяет распознать все виды перестроек гена ALK вне зависимости от партнера транслокации, что и является ее основным преимуществом. Для исследования могут быть использованы образцы гистологических срезов, цитологического материала, включая окрашенные архивные стекла. Недостатками метода являются его высокая стоимость и высокие требования к качеству образца и количеству опухолевых клеток в нем, поскольку для получения достоверного результата необходимо просмотреть не менее 50 ядер. Тем не менее, в США назначение кризотиниба невозможно без подтверждения транслокации методом FISH.

Другим, также теоретически универсальным методом является иммуногистохимическое исследование (ИГХ), позволяющее выявить высокую экспрессию химерного протеина в цитоплазме опухолевых клеток. Метод может быть быстро внедрен в практику и относительно недорог. Однако антитела, входящие в состав разработанных наборов для диагностики анапластической лимфомы, распознают не все конформационные формы протеина, возникающего в результате перестроек гена ALK при НМРЛ. Кроме того, экспрессия химерных протеинов при НМРЛ в ряде случаев достаточно слаба, а сам белок нестоек [19]. Тем не менее, в последнее время достигнуты существенные успехи в усовершенствовании методики – разработан новый клон антител (D5F3, Cell Signalling), появились новые системы детекции с возможностями значительного усиления сигнала [20]. Применение новых реагентов позволяет добиться практически 100,0% чувствительности в выявлении случаев с перестройкой гена ALK.

Третьим методом, используемым в диагностике реаранжировок ALK, является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Метод обладает высочайшей чувствительностью, позволяет работать с образцами, содержащими крайне низкое количество опухолевых клеток, способен сразу идентифицировать тип перестройки. Тем не менее, ОТ-ПЦР обладает несколькими существенными недостатками. Во-первых, метод очень требователен к качеству РНК, в особенности выделенной из фиксированного в формалине и залитого в парафин образца. Во-вторых, с помощью конкретного набора с использованием ОТ-ПЦР возможно выявить только те типы перестройки гена ALK, к которым подобраны специфические праймеры, что требует мультиплицирования исследования и существенных временных затрат. Достоинства и недостатки перечисленных методов отражены в таблице.

Методы, используемые для идентификации перестроек гена ALK
(по Murakami et al, Frontiers in Oncol, 2012)

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ, ИГХ – иммуногистохимический метод, ОТ-ПЦР – обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

Исследования генетической структуры злокачественных опухолей с целью поиска аберраций, потенциально чувствительных к терапии таргетными препаратами, продолжают интенсивно развиваться. Конечной целью этих исследований в будущем является определение индивидуального генетического портрета каждой опухоли и подбор индивидуального сочетания лечебных воздействий для каждого пациента. Выявление группы больных НМРЛ с перестройками гена ALK позволяет уже сейчас приблизиться к персонализации лечения, существенно увеличив эффективность терапии для этой, ранее практически некурабельной, категории пациентов.