Лабораторная оценка оксидативного стресса и антиоксидантной защиты

372

В норме во внеклеточном пространстве концентрация свободных радикалов и перекисей находится на пределе детектирования. Поэтому о состоянии окислительного стресса судят по вторичным продуктам окисления.

Оксидативным стрессом (ОС) называют процесс повреждения клетки в результате реакций окисления. У человека ОС является причиной или важной составляющей серьезных заболеваний, например атеросклероза, болезни Альцгеймера, а также старения. Патофизиологическими основами ОС служат увеличение продукции свободных радикалов и/или снижение антиоксидантной защиты организма.

Патофизиология оксидативного стресса

К основным типам свободных радикалов относят активные формы кислорода: супероксид-анион-радикал (-О2'), гидроксильный (-ОН'), пероксильный (-ROO') и алкоксильный радикалы (-RO'). В дальнейших окислительных реакциях образуются гидропероксиды (Н2О2) и липопероксиды (ROOH). Из активных форм азота наибольшее значение имеют оксид азота (NO) и пероксинитрит (ONOO-).

Первичным и главным источником супероксид-анион-радикала, который синтезируется путем одноэлектронного восстановления кислорода, является система цитохрома С. Также в образовании этого радикала играют роль липооксигеназа, циклооксигеназа, ксантиноксидаза, НАДН⁄НАДФН-оксидаза, цитохром-р450-оксидаза.

Пероксид водорода Н2O2 образуется под действием супероксиддисмутазы, катализирующей превращение в него супероксид-анион-радикала. Н2O2 регулирует активность протеинкиназы С, митогенактивируемых протеинкиназ, а также является ключевой молекулой в процессе апоптоза [12].

Основным источником NO является эндотелиальная NO-синтетаза, которая относится к семейству цитохром-р450-оксидаз. NO-синтетаза также может генерировать супероксид-анион-радикал. Пероксинитрит образуется в результате взаимодействия NO и супероксид-анион-радикала [6]. Он не инициирует новых цепных реакций, но обладает высокой модифицирующей активностью.

Антиоксидантами принято считать низкомолекулярные соединения, которые способны прерывать радикальные цепные реакции. Отдав атом водорода, антиоксиданты превращаются в стабильные радикалы, которые либо выводятся из организма, либо восстанавливаются. В организме существует два типа антиоксидантной защиты – внеклеточная и внутриклеточная.

К первому типу антиоксидантной защиты относят биомолекулы плазмы крови и внеклеточной жидкости, которые связывают радикалы и молекулы, стимулирующие образование свободных радикалов (свободные ионы железа и меди). К истинным антиоксидантам плазмы относят токоферол, аскорбат, а также некоторые аминокислоты и их производные (например тирозин, ацетилсеротонин, мелатонин, некоторые стероиды, билирубин) [20].

К молекулам, обеспечивающим внутриклеточную защиту от ОС (второй тип антиоксидантной защиты), принадлежат глутатион, аскорбат, убихинон, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, супероксид-дисмутатза и каталаза. Также к этой группе биологически активных веществ относят глутаредоксин и тиреодоксин. Эти белки восстанавливают SH-группы белков и играют важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-потенциала [25].

Патологическое действие свободных радикалов заключается в разрушении мембран клеток, модификации белков и ДНК. Наиболее подвержены этому воздействию фосфолипиды клеточных мембран, чему способствуют наличие двойных связей в остатках жирных кислот фосфолипидов, однородность среды, высокое содержание кислорода в липидном бислое. Также автоокислению подвержены гидрофобные участки – Na/K-АТФа-зы и Са-АТФазы, что приводит к нарушению их функционирования [13]. Ситуация приводит к увеличению тока ионов кальция внутрь клетки, активации фосфолипазы А2, высвобождению арахидоновой кислоты, что результируется развитием некроза клеток и тканей.

Конечным продуктом перекисного окисления липидов является малоновый диальдегид, который ингибирует простациклин, способствуя агрегации тромбоцитов и тромбообразованию. Специфическим ингибитором простациклинсинтетазы в микросомах эндотелия сосудов служит 15-гидроксиарахидоновая кислота. Наряду с малоновым диальдегидом, к конечным продуктам окисления липидов относятся диеновые конъюгаты гидроперекисей, кетодиены и кетотриены, которые также отражают степень выраженности ОС.

Диагностика выраженности окислительного стресса и состояния антиокислительной активности

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

В норме во внеклеточном пространстве концентрация свободных радикалов и перекисей находится на пределе детектирования. Поэтому о состоянии ОС судят по вторичным продуктам окисления: малоновому диальдегиду, 4-гидроксиалкенам, карбонильным и SH-rpyппам белков, отношению глутатион-SH ⁄ глутатион-SS-глутатион в плазме, диеновым конъюгатам и концентрации изопростаноидов в моче.

В настоящее время считается, что в качестве конечных продуктов окисления белка следует использовать те, что образуются под действием хлорсодержащих окислителей и при воздействии белков с кетоальдегидами, которые возникают при окислении сахаров [29].

8-гидрокси-2'-де(з)оксигуанозин

8-гидрокси-2'-де(з)оксигуанозин (8-ГДОГ) является конечным продуктом, не подвергающимся дальнейшему метаболизму. 8-ГДОГ в моче является стандартным биомаркером для оценки ОС и также может быть фактором риска развития болезней. Установлено, что у пациентов с заболеванием периферических артерий уровни 8-ГДОГ в сыворотке крови связаны отрицательной корреляционной зависимостью с маркерами оксида азота, а также со степенью нарушения ходьбы [18].

Использование 8-ГДОГ как биомаркера ОС было описано при многих заболеваниях, включая рак мочевого пузыря и предстательной железы, муковисцидоз, атопический дерматит и ревматоидный артрит. Также предполагается, что ОС ассоциирован с развитием нейродегенеративных заболеваний, например болезни Паркинсона, Альцгеймера и Гентингтона, и для них характерен повышенный уровень повреждения ДНК.

Считается, что данный биомаркер является показателем не только ОС, но и канцерогенеза. Тем не менее, его роль в организме может быть более сложной. Так C.Y. Ock и др. [21] установили, что 8-ГДОГ при экзогенном введении способен парадоксально уменьшать концентрацию активных форм кислорода, блокировать сигнальной путь нуклеарного фактора каппа-В и повышать экспрессию провоспалительных медиаторов (интерлейкинов ИЛ-1, ИЛ-6, циклооксигеназы-2, NO-синтетазы).

Для количественного определения 8-ГДОГ в биологических жидкостях используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием, газовую хроматографию с масс-спектрометрией и ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией. Также разработан ELISA-метод определения концентрации 8-ГДОГ с использованием моноклональных анти-8-ГДОГ антител, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью.

Фактор, индуцируемый гипоксией

Одним из проявлений ОС является активация образования новых мелких кровеносных сосудов (неоангиогенез). Исследования последних лет показали, что в поддержании баланса между потребностью клетки в кислороде и его доставкой ведущую роль играет кислородчувствительный протеиновый комплекс, обладающий транскрипционной активностью, – фактор, индуцируемый гипоксией.

Комплекс фактора, индуцируемого гипоксией (hypoxia-inducible factor – HIF), является гетеродимером, состоящим из одной α-субъединицы и одной β-субъединицы (HIF-α и HIF-β). HIF-α существует в виде ряда изоформ (HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α), отличающихся биологическими свойствами.

Экспрессия HIF-1α и HIF-2α регулируется кислородом путем гидроксилирования пролилового остатка в кислородзависимой области и присоединения кислорода к аспарагиновому остатку вблизи С-терминальной области HIF-1. Обе эти реакции катализируются 2-оксоглютаратзависимыми диоксигеназами [30].

β-субъединица, или арил-гидрокарбоновый рецептор ядерного транслокатора, экспрессируется постоянно и имеет важное значение в метаболизме ксенобиотиков. При низком уровне кислорода HIF-1α образует активный комплекс с HIF-β, в результате чего становится стабильным и соединяется с цитохромом Р300 [10].

В присутствии кислорода HIF инактивируется внутриклеточными ферментными системами. При гипоксии происходит активация HIF, который запускает экспрессию генов, ответственных за синтез эритропоэтина и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). При этом главным регулятором синтеза эритропоэтина в почках является HIF-1α, а в печени – HIF-2 [9].

Продукция NO в ответ на прекондиционирование может вызывать обусловленную HIF-1 экспрессию NO-синтетазы, защищая миокард от фатального ишемического поражения. Кроме того, HIF непосредственно влияет на продукцию эритропоэтина, который защищает клетки миокарда от апоптоза при синдроме ишемии/реперфузии.

Эксперименты показали, что у мышей с нормальной активацией HIF кратковременные эпизоды гипоксии достаточны для экспрессии эритропоэтина, в то время как при частичной недостаточности HIF-1α гипоксия не вызывает усиления продукции эритропоэтина и не сопровождается кардиопротекцией [26].

Также активация HIF служит протективным процессом при ишемии миокарда через экспрессию VEGF в сердце человека [14]. Снижение продукции VEGF представляет собой важный фактор риска развития инфаркта миокарда. Поэтому стратегия выбора терапии с целью повышения экспресии HIF-1α может способствовать ангиогенезу в ишемизированном миокарде.

Установлено, что пациенты с хроническими заболеваниями, сопровождающимися гипоксемией, метаболизируют лекарственные средства с более низкой скоростью, чем здоровые лица. В связи с этим токсический эффект приема лекарственных препаратов у них значительно повышен. Эта особенность связана со снижением активности изоформ цитохрома P450 и изменением ядерной транслокации HIF-1 [7].

В настоящее время существуют наборы для количественного определения HIF-1 в биологических жидкостях методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Окисленные липопротеины низкой плотности

В процессе перекисного окисления липидов образуются модифицированные (окисленные) липопротеины низкой плотности (о-ЛПНП), которые плохо распознаются рецепторами гепатоцитов и не подвергаются катаболизму с участием специфических рецепторов. о-ЛПНП захватываются макрофагами, которые при этом трансформируются в пенистые клетки, при их разрушении выделяются липидные кристаллы, входящие в состав атеросклеротических бляшек.

Возникающее при ОС снижение синтеза эндогенного NO за счет его связывания вторичными липидными радикалами уменьшает эндотелийзависимую вазодилатацию. Также о-ЛПНП вызывают дисфункцию эндотелия, которая появляется на ранних стадиях развития атеросклероза. Это обусловлено экспрессией хемокинов и молекул адгезии, например MCP-1, E- и P-селектина, VCAM-1, ICAM-1, на эндотелиальных клетках [15].

Существует ряд фактов, указывающих на отрицательную роль о-ЛПНП при синдроме ишемии/реперфузии. Так о-ЛПНП в большом количестве содержатся в атеросклеротических бляшках и поступают в кровоток при разрыве последних. Исследования показали, что перфузия миокарда кровью с высоким содержанием о-ЛПНП значительно уменьшает сокращения миоцитов в изолированном сердце крысы. Введение специфических антител к о-ЛПНП до ишемии приводит к уменьшению экспрессии о-ЛПНП и предотвращает повреждение, апоптоз и дисфункцию кардиомиоцитов [16].

Для характеристики уровня ОС используют определение содержания в плазме крови антител к о-ЛПНП. Считается, что этот показатель напрямую коррелирует со степенью ОС. Тем не менее, следует иметь в виду, что уровень этих антител отражает баланс между скоростью их синтеза и удалением иммунных комплексов из циркуляции. По данным Г.Т. Лютфалиевой [1], уровень о-ЛПНП в крови у здоровых лиц в возрасте 30–60 лет определялся как 116,2–234,2 нг/мл, с диапазоном колебаний значений от 71,0 до 1694,4 нг/мл. Возрастных различий в содержании о-ЛПНП и аутоантител не установлено.

Также разработан иммуноферментный метод для количественного определения растворимого рецептора о-ЛПНП в биологических жидкостях [4].

Фиколины

Система комплемента играет важную роль как медиатор повреждения тканей при ОС. Было показано, что ОС активирует систему комплемента через С2-зависимый механизм, а не через альтернативные пути ее активации [5].

Фиколины представляют собой группу олигомерных лектинов с субъединицами, состоящими из коллагена, фибриногена и лектина, которые связываются с фрагментами углеводов присутствующих на поверхности патогенных микроорганизмов, апоптотических и некротических клеток [32]. Их функция реализуется двумя путями: по лектин-связываемому пути активации комплемента и примитивным опсонофагоцитозом. Описано три вида фиколинов: фиколин-1 (М), фиколин-2 (L) и фиколин-3 (Н). Фиколин-1 экспрессируется в моноцитах, легких и селезенке; фиколин-2 – преимущественно в печени и секретируется в кровообращение; фиколин-3 – в печени и легких.

Установлено, что нарушение синтеза фиколинов может играть важную роль в патогенезе заболеваний, в т. ч. рецидивирующих респираторных инфекций, системной красной волчанки, IgA-нефропатии, преэклампсии. Так, в исследовании A. Halmos и др. (2012) установлено, что у беременных пациенток пороговые значения фиколина-2 менее 2,84 мкг/мл и фиколина-3 менее 24,0 мкг/мл с высокими чувствительностью и специфичностью ассоциировались с развитием преэклампсии и эклампсии [11]. При этом не установлено статистических различий в плазменных уровнях фиколинов при легкой и тяжелой формах заболевания, раннем или позднем начале, а также у беременных с задержкой и без задержки развития плода.

Также было показано, что концентрации фиколина-2 и фиколина-3 в крови были достоверно ниже у пациентов с клиникой ишемического инсульта по сравнению со здоровыми людьми [8]. При этом уровень фиколина-3 отрицательно коррелирует с тяжестью инсульта, а также с содержанием в пробах белка S100β как показателя размера инфаркта головного мозга.

В исследовании Z. Prohaszka и др. (2013) изучена особенность концентрации фиколина-2 и фиколина-3 в крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью [23]. Уровень фиколина-3, но не фиколина-2 достоверно снижался по мере утяжеления класса сердечной недостаточности и обратно коррелировал с концентрацией В-типа натрийуретического пептида (r = -0609, p < 0,001). При многофакторном регрессионном анализе уменьшение плазменной концентрации фиколина-3 было значимым предиктором смертности.

Таким образом, исследование содержания фиколинов в крови может дать ценную информацию по активации системы комплемента как одного из отражений ОС. Разработаны наборы для количественного определения концентрации фиколина-2 (L-фиколина) методом иммуноферментного анализа.

Нитротирозин

Повышенная продукция NO сопровождается образованием реактивных форм азота, этот процесс рассматривается как нитрозативный стресс. Нитрование как патологическая посттрансляционная модификация запускает процесс образования белковых агрегатов, вызывает формирование аутоантигенов и продукцию аутоантител. Нитротирозин – продукт нитрования тирозина при участии пероксинитрита и NO2; он считается маркером NO-зависимого ОС.

При ишемической болезни сердца (ИБС) плазменный уровень нитротирозина значительно повышается в сравнении со здоровыми индивидами. Так, по данным M.H. Shishehbor и др. [27], у пациентов с ИБС эти значения составили 4,8–13,8 против 2,2–8,4 мкмоль/моль тирозина у лиц без ИБС.

Для определения содержания нитротирозина используют многие методы: газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, масс-спектроскопическую детекцию, ИФА. Значения концентрации нитротирозина, получаемые при использовании разных методов, существенно различаются.

Антиоксидантная система

Супероксиддисмутаза

Супероксиддисмутаза (СОД) относится к антиоксидантным ферментам. СОД катализирует реакцию дисмутации:

2- + 2Н+→ О2 + Н2О2.

В зависимости от типа переходного металла-кофактора активного центра СОД выделяют Cu,Zn-СОД, Mn-СОД, Ni-СОД и Fe-СОД. В организме человека существует три типа СОД. СОД-1 (мол. масса 32,5 кДа) содержится в цитоплазме, СОД-2 (мол. масса 86–88 кДа) – в митохондриях, СОД-3 (мол. масса 135 кДа) локализуется экстрацеллюлярно. СОД-1 и СОД-3 являются Cu,Zn-CОД, тогда как СОД-2 – Mn-СОД.

При различных заболеваниях и состояниях активность СОД может значительно меняться. Так, выявлено ее повышение при язвенной болезни, очаговом туберкулезе, ревматоидном артрите в лейкоцитах, в воспалительной ткани пульпы зуба. Активность СОД снижена при гепатитах различной этиологии, бронхиальной астме, хронических обструктивных легочных синдромах, инфильтративном туберкулезе, ревматоидном артрите, атопическом дерматите и экземе, бактериальной инфекции, сепсисе. В условиях кратковременной активации свободно-радикальных процессов наблюдается напряжение антиоксидантной защиты, на что указывает повышение активности СОД [3]. При длительном или интенсивном ОС наступает истощение системы антиоксидантной защиты, в т. ч. снижение активности супероксиддисмутазы, что еще более усугубляет патологические процессы.

Существует ряд методов определения активности как внутри-, так и внеклеточной СОД. Большинство из непрямых спектрофотометрических способов основано на способности фермента тормозить окисление субстрата (например кверцетина, адреналина). Также предложен метод фотосенсибилизированной хемилюминесценции с участием рибофлавина. Разработаны наборы реагентов с использованием метода ИФА для количественного определения СОД в биологических жидкостях (сыворотка, плазма крови, амниотическая жидкость и проч.).

Глутатионпероксидаза

Глутатионпероксидаза (ГП) – фермент антиоксидантной защиты, катализирующий восстановление перекисей липидов до соответствующего спирта, а перекиси водорода – до воды. При этом восстановленная форма глутатиона под действием ГП превращается в окисленную. Отношение «восстановленный / окисленный глутатион» внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень внутриклеточной токсичности (ОС) [2]. У человека идентифицировано 8 изоформ ГП. При ишемии и гипоксии тканей отмечено последовательное снижение активности СОД, ГП, глутатионтрансферазы и каталазы.

Пероксиредоксин

Пероксиредоксины – семейство антиоксидантных ферментов, которые контролируют уровень цитокин-индуцированных пероксидов, участвующих в передаче клеточных сигналов [24]. Каталитическая активность пероксиредоксинов обусловлена окислением тиоловой группы R-SH редокс-активного цистеина до R-SOH пероксидным ионом.

В настоящее время ведутся исследования по изучению роли пероксиредоксинов в патологии человека. Установлено, что пероксиредоксин 1 обладает регуляторными функциями в клетках немелкоклеточной карциномы легкого и может служить новым прогностическим маркером и одной из терапевтических мишеней при этой патологии. Значения пероксиредоксина 6 выше 0,151 ЕД оптической плотности обладают чувствительностью 70,5%, специфичностью 62,7% и общей точностью 65,8% при диагностике плоскоклеточного рака легкого [33].

Имеется небольшое количество работ, посвященных изучению роли пероксиредоксинов при болезни Альцгеймера, ревматоидном артрите.

Разработан набор реагентов для количественного определения пероксиредоксина 1 в плазме, сыворотке крови, лизате клеток или буферных растворах методом ИФА.

Тиоредоксин

В антиоксидантной защите принимают участие пероксиредоксины, разлагающие перекись водорода, органические гидроперекиси и пероксинитрит. Кофактором этих ферментов в большинстве случаев являются изоформы тиоредоксина.

Тиоредоксин 1 человека – низкомолекулярный белок (12 кДа), локализованный в основном в цитоплазме, также обнаруживается в клеточном ядре и плазме крови. Тиоредоксин 2 синтезируется в виде белка-предшественника (18 кДа), который в ходе посттрансляционного протеолиза превращается в тиоредоксин 2 (12,2 кДа) и экспортируется в митохондрии.

В экспериментах показано, что тиоредоксин способен ослаблять повреждение эндотелиальных клеток у мышей при синдроме ишемии / реперфузии, что свидетельствует о защитном действии тиоредоксина при ишемическом повреждении миокарда с помощью механизма редокс-сигнализации [31]. При этом тиоредоксин довольно чувствителен к изменению равновесия «прооксиданты / антиоксиданты» и является внутриклеточным буфером против активных форм кислорода.

Экспрессия тиоредоксина может быть индуцирована при ОС. Было установлено, что уровень окисленного тиоредоксина в крови выше у пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования, и достоверно коррелировал с выраженностью сердечной недостаточности (р = 0,003), тяжестью органной недостаточности по шкале SOFA (р < 0,001 ) и концентрацией лактата в плазме крови (р < 0,001) [19]. Также выявлена отрицательная корреляция уровня тиоредоксина и содержания кислорода в артериальной крови (r = -0,17, p = 0,03). При этом максимальные значения содержания тиоредоксина в крови отмечались у наиболее тяжелых пациентов.

Интересно исследование с использованием наночастиц, покрытых тиоредоксином, для маркирования раковых клеток в организме [28]. Оказалось, что наночастицы, состоящие из гибридной молекулы тиоредоксина-метилтрансферазы и флуоресцеина, специфически связываются с мембранами раковых клеток, а не со здоровыми клетками окружения, что позволяет визуализировать клетки опухоли.

Интегративная оценка про- и антиоксидантного потенциала организма

В последние годы широкое распространение получила система «FRAS 4» для количественного интегративного определения свободных радикалов (d-ROM-тест) и уровня антиоксидантной защиты (BAR-тест). Принцип метода заключается в том, что, взаимодействуя с раствором хромогена, производные свободных радикалов, содержащиеся в анализируемом образце, изменяют цвет раствора, что регистрируется фотометрически при длине волны 505 нм.

Таким образом, изучение показателей ОС, развивающегося в результате дисбаланса между оксидантной и антиоксидантной системами, помогает раскрыть патогенез многих патологических процессов, оценить степень риска их возникновения, прогнозировать особенности течения заболевания. Своевременное устранение ОС помогает повысить эффективность профилактических и лечебно-реабилитационных мероприятий.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль