text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Импедансная агрегатометрия в контроле аспиринопрофилактики сосудистых тромбозов

  • 1 апреля 2014
  • 393

Возможность исследования агрегации тромбоцитов в цельной крови появилась с появлением агрегометров, основанных на технологии импеданса. Сейчас доступны агрегометры, сочетающие оптический принцип, импедансометрию и люминесцентную детекцию.

Активация тромбоцитов играет ключевую роль в формировании тромбов при атеросклеротическом поражении артерий, а также в патогенезе микроциркуляторных расстройств при тромбоцитозах. Среди средств, препятствующих избыточной агрегации тромбоцитов, наиболее доступным и эффективным препаратом остается ацетилсалициловая кислота (АСК) [1]. В известном мета-анализе приведены данные о снижении смертности от инфаркта миокарда или инсульта примерно на 25% при применении антитромбоцитарной терапии АСК, по сравнению с плацебо [2]. В соответствии с международными и отечественными рекомендациями, АСК является наиболее широко используемым препаратом также и для профилактики осложнений тромбоцитемии у пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями (ХМПЗ) [3]. Такие пациенты часто страдают от развития тромбозов и могут быть госпитализированы в стационар с неатерогенными инфарктами и ишемическими инсультами.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

С другой стороны, длительный прием аспирина может способствовать проявлению кровоточивости вплоть до геморрагических инсультов, особенно у пациентов с синдромом Виллебранда, который является противопоказанием к назначению аспирина [4]. Известно также, что тромбоцитозы при ХМПЗ часто обуславливают сниженную активность фактора Виллебранда (ФВ).

Обнаруженная высокая вариабельность ответа тромбоцитов на действие антиагрегантов обуславливает необходимость объективной оценки степени индивидуальной чувствительности к антитромбоцитарному действию АСК. Согласно результатам [5, 6], аспиринорезистентность тромбоцитов встречается у 5–45% обследуемых пациентов и в значительной степени зависит от используемого метода диагностики. В связи с этим, крайне важен вопрос стандартизации используемых тестов для персонифицированного подхода к подбору оптимальной дозы и режима приема АСК.

Основной методологический прорыв в исследовании физиологии тромбоцитов произошел в начале 1960-х гг., когда Борн и О’Брайен независимо друг от друга разработали простой оптический метод измерения агрегации тромбоцитов. Оптический тест по-прежнему является наиболее широко используемым в рутинной практике выявления тромбоцитопатий. Возможность исследования агрегации тромбоцитов в цельной крови появилась с появлением агрегометров, основанных на технологии импеданса. Сейчас для клинических лабораторий доступны агрегометры, которые сочетают оптический принцип, импедансометрию и люминесцентную детекцию для одновременного измерения интенсивности агрегации и секреции гранул тромбоцитов.

В России наиболее популярны агрегометры фирмы БИОЛА и Солар. Преимуществом этих приборов является возможность анализа размерности тромбоцитарных микроагрегатов. Ultegra-RPFA – еще один прибор, действие которого основано на применении метода иммунотурбидиметрии с оптической системой детектирования. Эта модификация агрегометрического прибора изначально разрабатывалась как система мониторинга действия антитромбоцитарных препаратов. Исследование не требует транспортировки проб и длительного ожидания результатов. В последние годы получил распространение аппарат для измерения агрегации, называемый «The Verify Now System» или «VerifyNow». Действие прибора также основывается на анализе светопропускания, но для исследования используется цельная кровь, и при этом весь процесс – от взятия крови до получения результатов – может быть проведен у постели больного в течение 10–15 мин. Все большее применение находит прибор – «анализатор функции тромбоцитов» (Platelet Function Analyser, PFA-200). В этом приборе цельная кровь пропускается через картридж с индукторами агрегации. Фактически измеряется не адгезия или агрегация тромбоцитов, а суммарная интенсивность всего процесса тромбоцитарного гемостаза. Вместе с тем, появились данные, что этот метод не обладает достаточной чувствительностью для измерения антитромботических эффектов таких препаратов, как ацетилсалициловая кислота и антагонисты АДФ-рецептора [7]. Не последнее место в выборе оптимального метода занимает и вопрос качества и стоимости используемых реактивов. Поэтому весьма актуальна адаптация технологии исследования к реагентам отечественных производителей.

Хотя самый распространенный оптический метод агрегометрии и имеет доказанное диагностическое значение, очевидны и его серьезные ограничения. Во время предварительного центрифугирования проб эритроциты, лейкоциты и крупные тромбоциты удаляются из образца. Эти клетки крови – важные регуляторы активности тромбоцитов, т. к. могут потреблять адениновые нуклеотиды, синтезировать и высвобождать простагландины и связывать простациклины [8, 9]. Вещества, которые регулируют функцию тромбоцитов: простациклин, циклический АМФ – могут деградировать до биологически неактивных продуктов во время центрифугирования. Кроме того, в плазме не наблюдается эффектов межклеточного взаимодействия тромбоцитов с лейкоцитами и эритроцитами, что также искажает нативные условия функционирования тромбоцитов.

Метод импедансной агрегометрии в цельной крови обходит эти проблемы, поскольку проба исследуется без предварительного центрифугирования, в присутствии всех форменных элементов. Было показано, что данный метод высокочувствителен к антитромбоцитарному действию АСК [10, 11]. Для агрегометра Chrono-Log нами были оптимизированы условия проведения теста инкубации пробы крови с АСК и последующей импедансной агрегометрии для определения характера изменения чувствительности тромбоцитов к препарату, а также выявлены гендерные отличия параметров агрегации у здоровых лиц [11, 13].

С целью определения возможности импедансной агрегометрии в оценке чувствительности тромбоцитов к АСК было обследовано: 50 больных ишемическим инсультом; 30 больных, перенесших геморрагический инсульт; 67 пациентов с выявленной мутацией V617F в гене янускиназы-2 (JAK2); 120 пациентов с ХМПЗ без мутации JAK2; а также 28 здоровых доноров. Индукция осуществлялась АДФ (НПО «Ренам», Россия) в конечной концентрации 5 мкМ и ристомицином (НПО «Ренам», Россия) в конечной концентрации 1 мг/мл. Оценка агрегации проводилась в пробах до и после предварительной 15 мин инкубации цельной крови с АСК в конечной концентрации 0,1 мМ [14]. Функцию тромбоцитов оценивали по параметру амплитуды – максимальному подъему агрегационной кривой. Уровень ФВ определяли на автоматическом коагулометре ACL TOP (IL) с комплектом реагентов VON WILLEBRAND KIT/AG (HemosIL, США) и с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа «Technozym vWF:Ag ELISA» и фотометра Bio-Rad, модель 680.

Исследование проводилось в рамках одобренного локальным этическим комитетом регистра «Генетические факторы риска тромбоза у жителей, проживающих на территории РФ, клиническое фенотипирование и тромбопрофилактика тромбоэмболических осложнений в онтогенезе» [15].

Статистическую обработку данных производили с помощью пакета программ Statistica 10.0, результаты представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (С2575). Учитывая отсутствие нормального распределения в большинстве вариационных рядов, значимость отличий в несвязанных выборках оценивали с помощью критерия Манна – Уитни. Наличие корреляционной связи оценивали с применением ранговой корреляции Спирмена. Различия оценивали как статистически значимые, при p < 0,05.

Как известно, правильную диагностическую информацию с помощью лабораторных исследований можно получить, опираясь на нормальные величины данного лабораторного теста, пределы внутри- и межиндивидуальных биологических колебаний и учитывая влияние на них различных факторов [16]. Результаты многих лабораторных исследований используются не столько для первичной диагностики, сколько для наблюдения за динамикой состояний пациентов, а в качестве инструмента мониторинга референтные интервалы в ряде случаев непригодны. Пациенты могут иметь необычные для себя результаты тестов, тем не менее, не выходящие за расчетные референсные пределы. Поэтому мы начали исследование с определения коэффициентов меж- и внутрииндивидуальной вариации параметров импедансной агрегометрии, полученных при обследовании здоровых доноров (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициенты вариации параметров импедансной агрегометрии при АДФ-индукции до и после инкубации с ацетилсалициловой кислотой у здоровых лиц

Параметр

Амплитуда

Скорость

Лаг-фаза

Площадь

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

до инку-
бации

после инку-
бации

Коэффициент межиндивидуальной вариации, %

35,7

64,0

38,0

50,4

39,2

51,8

38,3

67,4

Коэффициент внутрииндивидуальной вариации, %

5,8

11,2

18,8

20,7

15

24,3

10,0

16,1

Индекс индивидуальности

0,2

0,2

0,5

0,4

0,4

0,5

0,3

0,2

Примечание: Индекс индивидуальности вычисляется как отношение коэффициентов внутри- и межиндивидуальной вариации [16].

Коэффициент внутрииндивидуальной вариации для всех параметров после инкубации с АСК был выше, чем до инкубации, что может быть связано как с увеличением аналитической ошибки теста in vitro, так и с индивидуальными особенностями реакции тромбоцитов на АСК. Индекс индивидуальности для всех параметров импедансной агрегометрии оказался ниже 0,6, что свидетельствует о высокой индивидуальной вариабельности показателей и ограничивает применение референтных интервалов [16]. Таким образом, измерение агрегации в большей степени будет полезно для мониторинга состояния функциональной активности тромбоцитов в сравнении с данными предыдущих измерений. Поэтому оценка эффективности действия препарата должна проводиться до и после начала его использования.

Вместе с тем, в рутинной практике клинических лабораторий провести такое исследование, которое требует неоднократного повторного визита пациента, весьма проблематично.

Одновременно среди принимающих аспирин достаточно часто выявляются пациенты с существенно сниженной агрегацией – вплоть до полного отсутствия регистрации импеданса. Это может быть следствием повышенной реакции тромбоцитарного гемостаза на АСК и чревато высоким риском геморрагий.

При проведении теста предварительной инкубации проб крови с АСК in vitro нивелируется влияние возможных индивидуальных фармакокинетических особенностей: всасывания, распределения и метаболизма препарата – и можно сделать заключение о наличии аспиринорезистентности, обусловленной непосредственно тромбоцитарными функциями в условиях интактного клеточного окружения цельной крови.

Согласно полученным данным, и среди здоровых лиц, и среди пациентов с инсультом и ХМПЗ полностью отсутствовал эффект АСК in vitro, что свидетельствует об аспиринорезистентности их тромбоцитов, по всей видимости, обусловленной ЦОГ-1-независимым механизмом агрегации тромбоцитов. Поскольку лишь у единичных пациентов в нашей выборке (менее 1% обследованных) АСК не ингибировала эффект субстрата ЦОГ арахидоновой кислоты, можно полагать, что АСК практически всегда ингибирует активность ЦОГ тромбоцитов, но АДФ может индуцировать агрегацию и независимым от ЦОГ-1 путем. Вероятно, у данных лиц ЦОГ-независимые механизмы отличаются высокой активностью и компенсируют ингибирование ЦОГ-1 аспирином. В этом случае, очевидно, эффективным будет назначение, наряду с аспирином, блокаторов АДФ-рецепторов.

Выявлены пациенты с относительно высоким эффектом АСК, что является серьезным основанием ограничить дозу аспирина или заменить его другим дезагрегантом в связи с вероятностью развития геморрагических осложнений. Очевидно, данная реакция может усугубляться дефицитом ФВ.

Оценка значений эффекта АСК у пациентов с низким и высоким уровнем ФВ показала, что у пациентов с низкой концентрацией и активностью фактора наблюдается значительное увеличение эффекта АСК in vitro, что свидетельствует о повышенной чувствительности к аспирину и высокой вероятности возникновения кровотечений на фоне терапии. Напротив, у пациентов с высокими значениями концентрации ФВ отмечается относительно сниженная реакция на АСК, что может быть одним из факторов аспиринорезистентности.

Вместе с тем, один из важных аспектов функциональной активности тромбоцитов – секреция содержимого гранул – не регистрируется импедансометрией. Дефекты секреции тромбоцитов клинически могут проявляться в виде кровотечений, хотя при этом агрегация может оставаться в пределах нормальных значений. Оценка таких дефектов особенно актуальна для пациентов с ХМПЗ, когда вследствие приобретенной мутации могут возникать морфологические изменения клеток. Вполне очевидно, что для полной диагностики состояния тромбоцитов и чувствительности к АСК in vitro необходим комплексный метод оценки агрегации. Нами был предложен способ определения чувствительности тромбоцитов к аспирину, основанный на применении метода люминесценции в цельной крови [17]. Получая одновременно результат агрегации и секреции гранул, а также отслеживая изменение этих параметров в ответ на добавление АСК, можно охарактеризовать функциональное состояние кровяных пластинок и подобрать оптимальную схему лечения, не вызывающую побочных эффектов.

Таким образом, импедансный метод агрегации тромбоцитов в цельной крови является наиболее приближенным к реальным физиологическим условиям. При этом особенно важное значение имеет индивидуальный мониторинг функции тромбоцитов и сравнение полученных значений с предыдущими значениями данного пациента. Альтернативный вариант для оценки эффективности дезагрегантов заключается в использовании фармакологических тестов последовательной инкубации проб цельной крови с препаратом. У пациентов с ХМПЗ и острыми нарушениями мозгового кровообращения наблюдается существенный разброс параметров агрегации на фоне АСК: от случаев полной резистентности до полного подавления агрегационной активности тромбоцитов. Эти данные подтверждают актуальность персонализированного подхода с целью оперативной оценки эффективности и уровня риска при назначении дезагрегантов. Дополнительный тест, отражающий активность ФВ, может быть полезным прогностическим критерием в комплексе с агрегометрией, его низкий уровень свидетельствует о противопоказании к назначению АСК.

Перспектива увеличения диагностического потенциала импедансной агрегометрии заключается в проведении сочетанной оценки агрегации и интенсивности освобождения гранул при использовании люминесцентной технологии.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.