Лабораторная диагностика гонококковой инфекции

338

Лабораторные критерии диагноза гонококковой инфекции включают выделение N. gonorrhoeae из клинического образца, выявление антигена или нуклеиновой кислоты N. gonorrhoeae, грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры у мужчин.

К числу широко распространенных инфекций, передаваемых половым путем, относится гонококковая инфекция, являющаяся серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Несмотря на наблюдаемую в последние десятилетия тенденцию к снижению заболеваемости гонококковой инфекцией в Российской Федерации, уровень ее продолжает оставаться достаточно высоким (по данным государственной статистики, в 2011 г. он составил 38,2 случая на 100 тыс. населения) [1]. У мужчин заболевание чаще всего проявляется острым уретритом, у женщин в большинстве случаев гонококковая инфекция вызывает эндоцервицит. Нередко встречается бессимптомная инфекция – у мужчин до 10–20% случаев, у женщин – до 50% [2].

Основой для установления этиологического диагноза гонококковой инфекции в настоящее время являются результаты лабораторных, а именно – прямых методов исследования, позволяющих выявить возбудитель и/или его генетический материал. Лабораторные критерии диагноза гонококковой инфекции, принятые Европейским союзом (2002), включают: выделение N. gonorrhoeae из клинического образца, выявление антигена или нуклеиновой кислоты N. gonorrhoeae, обнаружение грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры у мужчин [3].

Диагностика гонококковой инфекции в Российской Федерации до последнего времени осуществлялась в соответствии с ранее изданными приказами:

  • от 04.12.1986 № 1570 «Об улучшении выявления больных гонореей и трихомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах поликлиник» [4] (утратил силу в связи с изданием приказа Минздрава России от 23.12.2002 № 398 «Об утверждении перечня приказов Минздрава СССР, признанных недействующими на территории Российской Федерации по разделу «Охрана материнства и детства» [5]);
  • от 22.04.1985 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [6];
  • от 12.07.1985 № 936 «Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза» [7].

В настоящее время диагностика гонококковой инфекции осуществляется на основании приказа Минздрава России от 20.08.2003 № 415 «Об утверждении протокола ведения больных “Гонококковая инфекция”» [8].

Возбудителем гонококковой инфекции является грамотрицательный диплококк, относящийся к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria, виду Neisserria gonorrhoeae [9]. Neisseria gonorrhoeae – неподвижный, неспорообразующий грамотрицательный аэроб, микроаэрофильный диплококк, растущий в условиях повышенной влажности, в атмосфере 5–10% СО2 при 37,0 ˚С на специальных питательных средах, отличается от других Neisseria способностью ферментировать только глюкозу, но не мальтозу, сахарозу или лактозу [2]. Помимо N. gonorrhoeae, патогенными для человека свойствами обладают N. meningitidis; также у человека выделяют непатогенные виды N. sicca, N. flavescens, N. perflava, N. mucosa и N. lactamica, вызывающие у лиц с иммунодефицитами оппортунистические поражения.

Известны прямые и непрямые методы диагностики гонококковой инфекции. К прямым методам лабораторной диагностики относятся: микроскопический, культуральный (бактериологический) метод и методы амплификации нуклеиновых кислот, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР); к непрямым методам относится определение антител к возбудителю. При диагностике гонококковой инфекции используют: микроскопию окрашенных препаратов (метиленовый синий, окраска по Граму), культуральное исследование (видовая идентификация), иммуносерологические исследования (определение антигенов и антител в сыворотке и плазме крови, другом биологическом материале) и молекулярно-биологические методы исследования (методы гибридизации ДНК и РНК, ПЦР). На настоящий момент абсолютным приоритетом в диагностике гонококковой инфекции являются прямые методы диагностики.

Микроскопический метод

Традиционно в качестве скринингового метода диагностики гонококковой инфекции используют препараты образцов биологического материала больных, окрашенные метиленовым синим и по Граму [10].

Окраска метиленовым синим является ориентировочной и позволяет оценить морфологию и расположение микроорганизмов в препарате. При микроскопии визуализируют: ядра клеток, окрашенные в синий цвет; цитоплазму, окрашенную в голубой цвет разной интенсивности; бактериальную микрофлору, окрашенную в синий цвет разной интенсивности. К отличительным признакам диплококков относят бобовидную форму и парное расположение: снаружи кокки имеют выпуклую поверхность, вогнутой стороной они обращены друг к другу; расположение диплококков напоминает форму кофейного зерна [2]. Дифференциальным признаком диплококка является отношение к форменным элементам препарата: внутриклеточное расположение по отношению к лейкоцитам и поверхностное – по отношению к клеткам плоского эпителия.

При окраске по методу Грама в препарате выявляются тинкториальные свойства бактерий. В зависимости от химической структуры клеточной стенки (наличие или отсутствие тейхоевых кислот), бактерии либо обладают способностью удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом (грамположительные), либо нет (грамотрицательные). Окраска по Граму позволяет выделять в препарате красно-розовые (грамотрицательные) или сине-фиолетовые (грамположительные) бактерии. Основной целью исследования является выявление грамотрицательных диплококков со специфической морфологией, а также определение степени выраженности лейкоцитарной реакции [2]. Одним из преимуществ окраски по Граму является возможность одновременного обнаружения смешанной микрофлоры и мицелия грибов.

Изучение окрашенных препаратов проводят в светооптическом микроскопе при увеличении 10х–100х. По быстроте и простоте выполнения, а также по минимальной стоимости метод микроскопии не имеет себе равных. Однако микроскопические исследования, наряду с относительной простотой и дешевизной, обладают субъективизмом, зависят от способа взятия и транспортировки материала, приготовления мазков; при использовании данного метода нередко встречаются трудности, связанные с необходимостью дифференцирования диплококка с другими грамотрицательными кокками, что напрямую зависит от квалификации персонала, проводящего исследование. Метод микроскопии отличается достаточно высокой чувствительностью и специфичностью при исследовании материала, полученного из мужской уретры, и гораздо худшими показателями при исследовании материала, полученного из различных очагов у женщин. У женщин гораздо труднее получить качественный материал, т. к. обсемененность цервикального канала существенно ниже, чем уретры, в материале из цервикального канала гораздо чаще присутствует сопутствующая микрофлора [11]. Метод микроскопии не используется для исследования фарингеальных и ректальных проб, обладает низкой чувствительностью для ранней диагностики гонококковой инфекции, бессимптомной инфекции; при использовании этого метода у женщин и детей устанавливается только предварительный диагноз гонококковой инфекции.

По результатам микроскопии формулируется одно из двух заключений:

  • грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококком, обнаружены;
  • грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококком, не обнаружены.

В случае положительного ответа, окрашенные препараты сохраняют для контроля в течение трех месяцев в условиях комнатной температуры.

Культуральный (бактериологический) метод

Культуральный метод, заключающийся в выделении чистой культуры гонококка, по сравнению с которым оценивают чувствительность и специфичность других методов диагностики гонококковой инфекции, служит для идентификации возбудителя. Принцип метода заключается в выделении N. gonorrhoeae на питательной среде с последующей морфологической, биохимической и видовой подтверждающей идентификацией [2].

Гонококки являются микроорганизмами, весьма требовательными к составу питательных сред, они могут расти только на средах, содержащих определенные концентрации аминокислот, пуринов и пиримидинов, а также усваиваемых источников энергии (т. е. глюкозы, пирувата или лактата) [12]. Для того чтобы улучшить условия роста гонококков, в среду для культивирования добавляют антибиотики, подавляющие рост контаминирующих бактерий и грибов.

Культивирование гонококков проводят на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством среды не менее 20 мл. Полученный от пациентов биологический материал тампоном наносится на поверхность среды чашки или сектора. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по оставшейся свободной площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3–4 разных направлениях, с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Непосредственно сразу после посева биоматериала чашки Петри помещают в CO2-инкубатор или в эксикаторы, которые обеспечивают сохранение стабильной атмосферы повышенного содержания углекислого газа (5–10%) и влажности за счет помещения в эксикаторы газогенерирующих СО2 пакетов и влажных тампонов. Чашки просматриваются через 18–24 ч инкубации, в случае отсутствия роста – через 48 ч. При отсутствии признаков роста через 72 ч инкубации, наблюдение прекращают. При выявлении характерных колоний проводится предварительная и видовая идентификация N. gonorrhoeae. Предварительная идентификация проводится путем:

визуальной оценки вида колоний. При соблюдении необходимых условий, через 24–48 ч инкубации наблюдается рост колоний N. gonorrhoeae, которые могут достигать размеров 0,5–1,0 мм в диаметре, округлой формы, прозрачных, серо-белого цвета, выпуклых, с блестящей поверхностью;

приготовления препаратов микроорганизмов из наиболее характерных колоний N. gonorrhoeae и окраски по Граму. В препаратах, приготовленных из культуры гонококков, наблюдают скопления грамотрицательных диплококков, имеющие более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии. В культуре отмечается полиморфизм кокков как по форме, так и по величине, что зависит от возраста культуры и происходящих процессов лизиса микроорганизмов. Интенсивность окраски кокков также зависит от фазы роста. Одновременно отмечают однородность и степень чистоты изучаемой культуры;

проведения оксидазного теста. Принцип метода основан на том, что в присутствии цитохромоксидазы и кислорода бесцветный краситель подвергается окислению и образует индофенол синий. Тестирование проводят одним из методов: прямым методом – с использованием жидкого реагента, 1 капля которого наносится на тестируемую колонию в чашке Петри; непрямым методом – с использованием бумажных дисков. Темно-лиловое или синее окрашивание колоний, появляющееся через 10–30 с, свидетельствует о положительной оксидазной реакции, отсутствие изменения цвета – об отсутствии данного фермента. Тест не является специфическим для N. gonorrhoeae и позволяет лишь установить принадлежность микроорганизма к роду Neisseria [2].

Для подтверждающей идентификации N. gonorrhoeae используются следующие тесты:

  • изучение ферментативной активности N. gonorrhoeae;
  • иммунологические/антигенные подтверждающие тесты;
  • молекулярно-биологические методы (ПЦР) – определение ДНК/РНК N. gonorrhoeae.

Исследование ферментативной активности N. gonorrhoeae позволяет дифференцировать N. gonorrhoeae от других Neisseria. Изучение ферментативной активности N. gonorrhoeae может проводиться в ростозависимых и ростонезависимых тестах. При проведении ростозависимых тестов сахара и другие субстраты вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется культивирование гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т. к. широко используемые ростонезависимые тесты дают возможность получить более быстрый и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно N. gonorrhoeae и исключить другие непатогенные нейссерии. Таким образом, ростонезависимые тесты изучают сформированные ферменты N. gonorrhoeae в концентрированном инокуляте микроорганизма, полученном из чистых колоний.

Существуют готовые наборы реагентов для изучения ферментативной активности N. gonorrhoeae. Оценка проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров – от красного к желтому (результат положительный). Проведение видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов [3].

Принципиальным преимуществом культурального метода является выделение жизнеспособной культуры микроорганизма, которую можно идентифицировать путем применения биохимических методов и использовать для оценки антибиотикочувствительности. К недостаткам следует отнести относительно высокую стоимость, трудоемкость, длительность и, самое главное, высокие требования к профессионализму персонала.

По результатам культурального исследования формулируется одно из двух заключений:

  • обнаружена (выделена) N. gonorrhoeae;
  • N. gonorrhoeae не обнаружена (не выделена).

Окончательное подтверждение наличия N. gonorrhoeae проводится с помощью иммунологических тестов и только в референс-лабораториях [2, 3].

Молекулярно-биологические методы исследования

Диагностические тесты, основанные на ДНК-технологиях, стали внедряться в практику с начала 1990-х гг. Для выявления N. gonorrhoeae могут быть использованы молекулярно-биологические методы, такие как ПЦР, а также методы, основанные на гибридизации [13]. Существует много коммерческих методов, позволяющих определять N. gonorrhoeae с высокой чувствительностью и в большинстве случаев – с высокой специфичностью. Однако результаты, полученные при использовании этих методов, должны оцениваться в связи с клинической ситуацией, т. к. после проведенного лечения гонококковой инфекции в некоторых случаях ДНК может определяться в образцах до 2–3 недель после лечения.

К преимуществам молекулярно-биологических методов стоит отнести их высокую чувствительность и специфичность (100%), быстроту и возможность автоматизации, возможность использования неинвазивных материалов (например мочи), отсутствие необходимости в живых микроорганизмах, возможность выявления нескольких патогенов в одном образце биоматериала. К недостаткам относят: проблемы со специфичностью в некоторых тест-системах (например, ложноположительные результаты из-за присутствия в пробе непатогенных нейссерий), дорогостоящее оборудование, риск контаминации, отсутствие возможности определения чувствительности к антибактериальным препаратам и характеристики штаммов [3].

По результатам молекулярно-биологического исследования формулируется одно из двух заключений:

  • обнаружена ДНК N. gonorrhoeae;
  • ДНК N. gonorrhoeae не обнаружена.

Таким образом, в диагностике гонококковой инфекции микроскопический метод исследования позволяет заподозрить наличие гонококковой инфекции при обнаружении грамотрицательных внутриклеточных и/или внеклеточных диплококков, морфологически сходных с гонококком, в препаратах образцов биологического материала больных, в то время как с помощью культурального и ПЦР методов производится видовая идентификация возбудителя.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×