Цитокины при остром коронарном синдроме

71

Концентрация цитокинов в кровотоке отражает текущее состояние иммунной системы пациента. Значительно больше информации, вероятно, может быть получено при исследовании цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров крови.​ 

Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время занимают первое место среди причин смертности населения всего мира, что по данным ВОЗ составляет 30% всех случаев смерти, из них 45% в результате ишемической болезни сердца (ИБС) [6]. Развитие ИБС обусловлено атеросклеротическим очаговым поражением и сужением просвета коронарных артерий, приводящим к недостаточному кровоснабжению сердца и его патологическим изменениям. При атеросклерозе, часто наблюдается гиперлипидемия, отложение и накопление на внутренней оболочке сосудов липопротеинов и доставляемого ими холестерина, которые сопровождаются разрастанием соединительной ткани и образованием, так называемых «атеросклеротических бляшек». Процессам формирования, а также дестабилизации атеросклеротической бляшки, ведущей к атеротромботическим осложнениям, способствует характерный для воспаления приток моноцитов в интиму артерий [11]. В развитии атеросклероза участвует множество разнообразных факторов, механизмы его патогенеза на сегодняшний день до конца не изучены. Тем не менее, многие исследователи сходятся во мнении что атеросклероз относится к хроническим воспалительным заболеваниям, а система врожденного иммунитета вносит важный вклад в его возникновение и прогрессирование [10].

Основным звеном регуляции процессов воспаления являются интерлейкины (IL) - 1, 6, 8, 10 и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α).  До настоящего времени у больных ИБС, в том числе с ее наиболее социально-значимыми проявлениями в виде острого коронарного синдрома (ОКС), включающего нестабильную стенокардию (НС) и острый инфаркт миокарда (ОИМ), концентрацию данных цитокинов исследовали преимущественно в сыворотке крови. В частности, было показано, что концентрации IL-1 и IL-6 в крови ассоциированы при ИБС с повторными коронарными событиями [9].

В исследовании X.H. Wang выявлено, что повышенные уровни IL-6 и С-реактивного белка могут быть использованы для определения стабильности бляшки при ОКС и положительно коррелировали (r = 0.836) между собой [16].

Установлено, что активное участие в процессе развития атеросклероза принимают также моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (МСР-1) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), вызывающие при ишемии инфильтрацию мононуклеарных клеток и развитие коллатерального кровообращения [3, 1].

Следует отметить, что концентрация цитокинов в кровотоке отражает текущее состояние иммунной системы пациента, значительно больше информации для выявления дисбаланса данных регуляторов иммунитета, вероятно, может быть получено при исследовании цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров крови. Результаты оценки спонтанной секреции цитокинов при этом дают возможность оценить активацию данных клеток в организме обследуемого человека, а митоген-индуцированной – их потенциальную способность к синтезу цитокинов [2, 4, 15].

При разработке набора реагентов «ЦИТОКИН–СТИМУЛ–БЕСТ», содержащего все необходимые компоненты для культивирования и митогенной активации ex vivo клеток цельной крови в клинико-диагностических лабораториях, основной задачей был выбор митогенов, обеспечивающих наиболее эффективную и стандартизованную стимуляцию различных цитокинов клетками цельной крови.

С этой целью было проведено исследование, в котором после активации мононуклеаров в пробах крови 21 добровольца различными митогенами (липополисахарид (LPS), конканавалин А (ConA), фитогемагглютинин P (PHA-P) и фитогемагглютинин М (PHA-M)) в полученных супернатантах анализировали концентрацию секретируемых цитокинов.

В результате сравнительного анализа полученных данных (рис.) было показано, что интенсивность секреции различных цитокинов мононуклеарными клетками цельной крови зависит от природы используемого митогена. Слабее других митогенов продукцию почти всех изученных цитокинов, а особенно IL-1β, IL-6 и INF-γ, стимулировал ConA. Воздействие LPS на клетки крови было неоднозначным: секреции IL-2 не выявлено, слабая индукция отмечена – для IL-17, однако продукция клетками TNF-α, IL-1β и особенно IL-18 достигала высоких значений. 

Цитокины при остром коронарном синдроме

Цитокины при остром коронарном синдроме

Концентрация TNF-alfa, пг/мл

PHA-M PHA-A Con-A LPS Mit Medial 25%–75% Min-Max

Концентрация INF-gamma, пг/мл  INF-gamma

Цитокины при остром коронарном синдроме

Цитокины при остром коронарном синдроме

Концентрация IL-6, пг/мл

Концентрация IL-1beta, пг/мл

Цитокины при остром коронарном синдроме

Цитокины при остром коронарном синдроме

Концентрация IL-2, пг/мл

Концентрация IL-10, пг/мл

Цитокины при остром коронарном синдроме

Цитокины при остром коронарном синдроме

Концентрация IL-17, пг/мл

Концентрация IL-18, пг/мл

Цитокины при остром коронарном синдроме

Цитокины при остром коронарном синдроме

Концентрация IL-1RA, пг/мл

Концентрация IL-8, пг/мл

Рисунок. Концентрации цитокинов (пг/мл) в супернатантах крови доноров после стимуляции PHA-P, PHA-M, LPS, ConA и комплексным митогеном (Mit) (N=21).

Таким образом, полученные нами результаты подтвердили опубликованные ранее данные о том, что ни один из известных митогенов не может индуцировать секрецию представительного ряда цитокинов различными клетками крови [7].

Альтернативный метод эффективной стимуляции клеток крови смесью LPS, PHA и ConA был применен еще в 1975 году [12]. Авторы данного исследования показали, что активность этой смеси митогенов значимо выше, чем стимуляция мононуклеарных клеток каждым из них в отдельности. В результате проведенных нами экспериментов было показано, что смесь митогенов PHA-M, PHA-P, ConA и LPS способна индуцировать продукцию клетками крови всех изучаемых цитокинов. Дальнейшие исследования позволили подобрать оптимальное соотношение митогенов в комплексе PHA-M:PHA-P:ConA:LPS – 2:2:2:1 и выбрать их оптимальную суммарную концентрацию в исследуемом образце разбавленной крови – 14 мкг/мл. Полученные нами данные не подтвердили наличие у данной смеси митогенов синергизма стимулирующего действия, но показали, что она может быть применена для оценки потенциальной способности клеток крови к секреции практически всех изучаемых нами цитокинов (рис.). Кроме того, было установлено, что совокупности значений концентрации ключевых цитокинов иммунного ответа INF-γ, TNF-α, IL-6 и IL-1β в супернатантах, получаемые при активации мононуклеаров цельной крови этим комплексом митогенов, соответствуют нормальному распределению. Это позволяет проводить корректную статистическую обработку результатов исследований, связанных со сравнениями индуцированной продукции данных цитокинов в различных группах пациентов.

Результаты экспериментов по стимуляции клеток цельной крови смесью поликлональных активаторов: LPS, ConA, PHA-P и PHA-M – послужили основой для создания набора реагентов «ЦИТОКИН–СТИМУЛ–БЕСТ», предназначенного для культивирования и митогенной активации клеток цельной крови в системе ex vivo.

Для определения референтных диапазонов спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов клетками крови здорового человека, получаемых с помощью набора «ЦИТОКИН–СТИМУЛ–БЕСТ», использовали образцы периферической крови 51 условно здорового добровольца – 15 мужчин и 36 женщин, в возрасте от 22 до 60 лет (средний возраст 38,6 лет) (табл. 1). Спонтанную и митоген-индуцированную продукцию цитокинов определяли как их концентрацию, измеренную в супернатанте после 24 часового культивирования, полагая, что для большинства исследуемых цитокинов за этот период устанавливается равновесие между синтезом и деградацией.

Таблица 1

Уровни спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов клетками цельной крови условно здоровых доноров при использовании наборов «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ»

Цитокины

Продукция цитокинов, пг/мл

Спонтанная

Индуцированная комплексом митогенов

Медиана

LQ-UQ*

Медиана

LQ-UQ*

ИНФ-α

0

0–3

1

1–3

ИЛ-4

0

0–1

2

1–5

ИНФ-γ

0

0–6

1337

281–4335

ИЛ-1β

20

5–50

1623

707–4325

ИЛ-1РА

570

300–1100

4260

1410–7510

ИЛ-18

47

38–60

67

52–92

ИЛ-6

140

30–280

29200

11450–42200

ФНО-α

14

7–30

3790

2810–5700

ИЛ-8

1445

665–2500

31100

19800–45800

ИЛ-10

14

0–23

190

66–335

ИЛ-2

0

0–2

48

28–90

ИЛ-17

3

2–5

45

18–205

МСР-1

81

45–950

4580

3050–6300

G-CSF

0

0-1

562

445–710

GM-CSF

0

0-0,5

51

29–69

* – LQ-UQ – диапазон квартильных отклонений (25−75%).

Для изучения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови у больных острым коронарным синдромом и оценки их значимости для выявления иммунологических изменений и характеристики  воспалительного процесса обследованы 27 пациентов, госпитализированных с диагнозом ОКС в кардиологическое отделение Новосибирской муниципальной клинической больницы скорой медицинской помощи № 2. После  дополнительного клинического обследования все пациенты были разделены на 2 группы. Первая группа включала 15 больных с ОИМ: 8 женщин (средний возраст 67 лет) и 7 мужчин (средний возраст 54 года); вторая - 12 пациентов с НС: 6 женщин и 6 мужчин (средний возраст женщин 65 лет, мужчин - 58 лет). Инфаркт миокарда был подтвержден клинически (болевой приступ более 30 мин), электрокардиографически (подъем сегмента ST на кардиограмме), а также лабораторными методами исследований (определение тропонина Т, креатинфосфокиназы и ее МВ-фракции).

Оценку способности мононуклеаров к продукции цитокинов проводили с помощью набора реагентов для культивирования и митогенной активации клеток цельной крови «Цитокин-Стимул-Бест». Непосредственно после отбора из кубитальной вены 1 мл крови вносили во флакон, содержащий 4 мл поддерживающей среды (DMEM), гепарин (2,5 Ед/мл), гентамицин (100 мкг/мл), и L-глютамин (0,6 мг/мл). Этот флакон использовали для изучения спонтанной продукции цитокинов. Для митогенной стимуляции 1 мл полученной разбавленной крови переносили во флакон со смесью поликлональных активаторов: липополисахарида, конканавалина А, фитогемагглютинина P и фитогемагглютинина М. Оба флакона инкубировали в течение суток при 37°С, затем клетки крови осаждали на центрифуге при 10000 G в течение 3 мин, супернатанты после отделения осадка замораживали и хранили при -40°С до проведения количественного анализа цитокинов.

Для определения концентрации интерлейкинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18), рецепторного антагониста IL-1 (IL-1ra), интерферонов (IFN-α, IFN-γ), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), VEGF и МСР-1 в полученных супернатантах использовали соответствующие наборы реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). В качестве референтного диапазона уровня спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов клетками цельной крови были приняты значения, полученные при обследовании условно здоровых доноров (табл. 1).

Сравнение средних значений показателей спонтанной и индуцированной продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови в группах больных ОИМ и НС проводили отдельно для мужчин и женщин с использованием двустороннего t-критерия с учетом однородности дисперсий, которую оценивали по двустороннему F-критерию. Достоверным считали отличия при уровне значимости р≤0,05. Данные представлены в таблицах как среднее значение ± стандартное отклонение среднего (M±Sm).

При исследовании венозной крови пациентов с НС уровень спонтанной продукции мононуклеарами провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и МСР-1 выше значений референтного интервала был выявлен только у мужчин, а противовоспалительного IL-10 - у всех больных данной группы (табл. 2). В то же время у пациентов с ОИМ значения IL-10 соответствовали референтным значениям однако уровень продукции противовоспалительного IL-1ra был значительно повышен. При этом показатели IL-10 и IL-1ra в группах больных ОИМ и НС имели достоверные отличия.

Таблица 2

Уровень спонтанной продукции цитокинов клетками крови пациентов с ОКС (M±Sm), пг/мл 

группы больных

ОИМ

НС

Мужчины

Женщины

Мужчины

Женщины

IL-4

0,65±0,2

0,10±0,07

0,70±0,29

0,17±0,08

IL-2

7,3±4,1

1,6±0,4

4,1±3,2

2,0±0,4

IFN-α

0

0

0

0

IL-17

0

0

0

0

IL-18

70±9*

59±9*

41±6*

34±5*

IL-10

10±1*

12±7*

32±8*

27±2*

МСР-1

3161±697

2449±455*

1608±402

949±173*

IFN-γ

1,5±0,4

0,3±0,2

0,9±0,4

0,4±0,2

IL-1ra

1993±232*

2038±373*

882±124*

638±77*

IL-1β

260±32*

238±50*

119±21*

48±13*

VEGF

172±32 

267±61*

136±24

37±7*

TNF-α

21±6

12±4

12±6

6±2

IL-6

741±356*

726±197*

334±125*

165±48*

IL-8

2883±843

5254±2332

2214±553

903±145

*- достоверные отличия р≤0,05 при сравнении между группами ОИМ и НС

Спонтанная продукция провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и МСР-1 у всех пациентов с ОИМ значительно превышала как референтные значения, так и ее уровни, определенные у больных НС. Кроме того, достоверные отличия между группами ОИМ и НС выявлены для продукции IL-18 у всех пациентов, а МСР-1 и VEGF - только у больных женского пола.

При исследовании митоген-индуцированной продукции цитокинов было показано, что уровень образования TNF-α у всех больных ОКС был значительно ниже нормальных значений (табл.3). При этом продукция противовоспалительного цитокина IL-1ra была выше референтного предела,  а IL-18 - соответствовала ее верхней границе. Отмечен также высокий уровень продукции VEGF у всех больных ОИМ и у мужчин с НС. Показатели продукции IL-18 и IL-6 у пациентов этих двух групп находились в интервале нормальных значений, но были достоверно выше у больных с ОИМ.

Таблица 3

Уровень митоген-индуцированной продукции цитокинов клетками крови пациентов с ОКС (M±Sm), пг/мл

группы больных

ОИМ

НС

Мужчины

Женщины

Мужчины

Женщины

IL-4

2,2±0,65

2,3±0,8

4,5±1,55

3,4±1,4

IL-2

48±11

66±23

66±23

120±35

IFN-α

0

0

0

0

IL-17

98±42

64±14

64±20

105±20

IL-18

76±10*

63±8*

45±6*

40±3*

IL-10

265±73

281±45

400±201

298±60

МСР-1

3084±863

3026±536

2555±536

3474±1007

IFN-γ

2787±642

3514±1748

1495±354

2966±1582

IL-1ra

13546±3829

10933±2905

11793±2198

9996±1767

IL-1β

1703±356

1748±489

1104±123

989±166

VEGF

129±31

132±26

122±18

72±19

TNF-α

1230±276

1349±359

987±251

1218±250

IL-6

17802±3224*

24568±3077*

7958±3155*

14872±1823*

IL-8

30308±9061

27341±6133

22683±4182

24836±5415

*- достоверные отличия р≤0,05 при сравнении между группами ОИМ и НС

В результате проведенного исследования у пациентов с ОКС выявлена повышенная спонтанная секреция мононуклеарами периферической крови провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-1β, характерная для воспалительных процессов. Показателем развития острого воспалительного процесса у больных ОИМ, очевидно, может служить высокая продукция хемокинов IL-8 и МСР-1, свидетельствующая об активации нейтрофилов и моноцитов. Достоверное увеличение уровней IL-18, IL-1ra, и снижение IL-10 являются показателями избыточной активации моноцитов и недостаточной компенсаторной активности регуляторных Т-клеток при ОИМ. Высокая спонтанная продукция VEGF свидетельствует о развитии ишемии у больных данной группы.

Особое внимание обращают на себя результаты определения митоген-индуцированной продукции IL-1ra, IL-10 и TNF-α (первые два цитокина отнесены многими исследователями к «антиатерогенным», а третий - к «атерогенному» типу) [14]. Ранее в работах, проведенных с использованием трансгенных мышей и изучением атероматозных бляшек человека, было показано, что регуляторные Т-клетки, активно участвуя в атерогенезе, секретируют IL-10, который способствует стабильности бляшки за счет фиброза [5, 8].

Результаты, полученные в настоящей работе, ставят под сомнение правильность отнесения IL-1ra и IL-10 к антиатерогенным, а TNF-α к атерогенным факторам. Показано, что у всех пациентов с ОКС повышена относительно нормы митоген-индуцированная  продукция цитокинов IL-1ra, IL-10, а TNF-α - наоборот понижена, однако значимых отличий в показателях между группами больных НС и ОИМ не было выявлено. Это согласуется с опубликованными ранее данными, полученными в экспериментальных моделях с использованием мышей, дефицитных по TNF-α, которые убедительно продемонстрировали, что потеря TNF-α не влияет на развитие атеросклеротических поражений [13].

Выполненное в настоящей работе определение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у больных острым коронарным синдромом позволило оценить и сопоставить активность мононуклеаров периферической крови у больных с ОКС (включая пациентов с ОИМ и НС) и здоровых лиц. Авторы полагают, что уровень спонтанной продукции IL-6 и IL-1β отражает течение воспалительного процесса при ОКС, IL-8 и МСР-1 характеризует развитие острого воспалительного процесса, а VEGF - ишемии у больных с ОИМ. Данные о повышенной митоген-индуцированной продукции противовоспалительных цитокинов IL-1ra, IL-10 и низкой - провоспалительного фактора TNF-α свидетельствуют о глубоких изменениях в иммунной системе у больных ОКС. Таким образом, результаты, полученные в настоящей работе, показывают перспективность дальнейших исследований спонтанной и индуцированной продукции цитокинов для оценки иммунологических изменений и поиска способов коррекции нарушений иммунного статуса  у больных ишемической болезнью сердца.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль