• Главная страница
  • » Статьи
  • » Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

2637

Более двух десятилетий исследователи и клиницисты пытаются разработать метод лечения, который гарантировал бы эффективное восстановление кожных покровов пациентам, получившим тяжелые ожоговые и травматические повреждения либо страдающим трофическими язвами различной этиологии. На сегодняшний день наиболее эффективной является операция аутотрансплантации кожи. В перспективе, на смену ей может придти аутотрансплантация выделенных из биоптатов неповрежденных участков кожи и размноженных в культурах in vitro клеток-предшественниц кератиноцитов на трехмерных матриксах. Главным недостатком этого подхода остается то, что на экспансию кератиноцитов в культурах in vitro перед трансплантацией требуется около 3 недель. В течение всего этого времени пациент подвергается риску инфицирования и обезвоживания открытой ожоговой раны. Недели перед проведением аутотрансплантации остаются тем критическим периодом, в котором необходимо обеспечить максимальную защиту поврежденных покровов. В качестве временного покрова возможно использование децеллюляризованного трупного кожного лоскута, однако доступность подобного материала ограниченна, а его применение нередко приводит к развитию реакций воспаления.

Чтобы избежать применения временных трансплантатов и операций аутотрансплантации, предпринимается множество попыток разработки «эквивалентов кожи» на основе инертных синтетических и тканеинженерных матриксов, обычно содержащих коллаген I типа и аллогенные клетки (дермальные фибробласты и реже – фибробласты и кератиноциты). Однако до настоящего времени ни один из этих продуктов не продемонстрировал высокой эффективности в лечении пациентов с обширными глубокими ожогами.

Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека могло бы стать решением проблемы создания эквивалентов кожи, пригодных для трансплантации, позволив получать необходимые типы клеток (дермальные фибробласты и кератиноциты) в неограниченном количестве. Основным препятствием использования данного подхода остается недостаточная эффективность протоколов дифференцировки ЭСК в требующиеся типы клеток и потенциальная туморогенность ЭСК . Единственная оставшаяся в предназначенной для клинического использования клеточной культуре недифференцированная эмбриональная стволовая клетка теоретически может привести к формированию у реципиента тератомы – опухоли, развивающейся из ЭСК при их трансплантации.

В 2003 г. были впервые получены фрагменты кожи на основе кератиноцитов, дифференцированных из ЭСК мыши. С тех пор предпринималось множество попыток разработки протокола дифференцировки ЭСК человека в кератиноциты, однако полученные клетки по неясным причинам не были способны к активной пролиферации. Основная задача этих исследований – создание функционального стратифицированного эпидермиса с базальным слоем, содержащим малодифференцированные клетки-предшественницы кератиноцитов, – до настоящего времени так и не была решена.

В журнале The Lancet были опубликованы результаты работы научной группы, возглавляемой профессором C. Baldeschi. Исследователям впервые удалось получить эквиваленты кожи, аналогичные по своей структуре нормальной коже человека. В своей работе ученые создали протокол дифференцировки, моделирующий длительный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в базальные кератиноциты эмбриона. Ключевым звеном этого протокола оказалось время, в течение которого клетки культивировали в среде, содержащей индукторы дифференцировки. Интересно отметить, что до этого ученые многие годы не обращали внимания на временные параметры, сосредоточившись на разнообразных химических индукторах дифференцировки.

ЭСК человека линий Н9 и SA01 культивировали на фидерном слое инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в течение 40 суток в питательной среде, содержащей 0,5 ммоль/л BMP4 (bone morphogenetic protein 4) и 0,3 ммоль/л аскорбиновой кислоты. В течение первых 20 суток культивирования в клетках постепенно снижалась экспрессия эмбриональных маркеров Oct4 и Nanog, а к 40 суткам прекращалась экспрессия маркера SSEA3, что было подтверждено количественным ПЦР-анализом, флуоресцентно-активированным клеточным сортингом (FACS) и методом иммуноцитохимии. Параллельно с утратой эмбриональных маркеров в ЭСК происходила последовательность молекулярных событий, аналогичная происходящей в клетках развивающихся эмбриональных покровов. В течение первых 10 суток нарастала продукция кератинов 8 и 18, после чего она начинала снижаться, сменяясь продукцией кератинов 5, 14 и 18. К 40 суткам в клетках активно продуцировались кератины 5 и 14, а экспрессия кератина 18 прекращалась. В контрольных культурах нормальных базальных кератиноцитов человека наблюдался аналогичный паттерн экспрессии кератинов, более того, в базальных кератиноцитах и кератиноцитах, полученных из ЭСК (К-ЭСК), совпадала и внутриклеточная локализация данных маркеров. Единственное отличие двух типов клеток заключалось в том, что в К-ЭСК не было отмечены экспрессии антигенов HLA-ABC и HLA-DR.

Эффективность дифференцировки в базальные кератиноциты была одинаковой для обеих использованных линий ЭСК и составляла около 95%. После селекции клетки были высеяны на фибриновый матрикс, заселенный дермальными фибробластами человека. После того, как монослой К-ЭСК на поверхности матрикса достигал конфлюэнтности, полученные «кожные» лоскуты трансплантировали мышам с иммунодефицитом (nu/nu, n=5). Через 10-12 недель после трансплантации образцы ткани фиксировали и оценивали иммуногистохимическим методом на присутствие специфических маркеров дифференцировки кератиноцитов. Следует отметить, что ни у одного из животных не было выявлено развития опухолей.

Было показано, что К-ЭСК формируют нормальный стратифицированный эпителий. В базальном слое наблюдали экспрессию кератинов 5 и 14, интегринов α6 и β4, коллагена VII типа и ламинина 5. В слоях, лежащих над базальным, обнаруживался кератин 10, а инволюкрин и филаггрин – маркеры терминальной дифференцировки кератиноцитов, – продуцировались только в верхних слоях эпидермиса. Структура и плотность образовавшихся покровов также повторяла структуру и плотность нормальной кожи человека. При этом в базальном слое происходила пролиферация клеток, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер Ki-67. Таким образом, полученная искусственная кожа была способна к обновлению.

Авторы этой работы уверены, что полученные ими эквиваленты кожи в будущем могут успешно применяться в качестве временных покровов, защищающих открытые раны перед предстоящей аутотрансплантацией. Возможно, они также смогут стать полноценной заменой аутотрансплантатов. Самоподдерживающиеся линии ЭСК решат проблему доступности материала, а низкая экспрессия молекул HLA на мембране полученных К-ЭСК должна свести к минимуму вероятность развития иммунных реакций при использовании трансплантата.

Выполненных на сегодняшний день экспериментов недостаточно для внедрения полученного продукта в клиническую практику. Для подтверждения безопасности использования искусственной кожи на основе К-ЭСК необходимо проведение расширенных доклинических испытаний на большем количестве экспериментальных животных, доказательство геномной стабильности и всесторонняя характеристика К-ЭСК. Тем не менее, данная работа – первое доказательство возможности получения чистых культур базальных кератиноцитов из ЭСК человека. Более того, это исследование является первым принципиально новым шагом в разработке разнообразных тканеинженерных эквивалентов кожи человека, история которых насчитывает уже более 20 лет.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно


Рассылка




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль