Современные подходы к лабораторной диагностике туберкулеза

3316
Современные подходы к лабораторной диагностике туберкулеза

(по материалам, предоставленным компанией ГЕМ  http://www.hemltd.ru/publications)

Туберкулез продолжает оставаться одним из самых опасных инфекционных заболеваний — каждый третий житель планеты инфицирован туберкулезными микобактериями. Как следствие, в новом тысячелетие число его жертв катастрофически выросло: ежегодно диагностируют свыше 8 млн. новых случаев туберкулезной инфекции, а 2 млн. человек умирает от нее. Массовая вакцинация БЦЖ и применение большого арсенала средств химиотерапии туберкулеза не позволяют победить туберкулез, хотя без них указанные выше цифры были бы значительно более высокими. Безусловно, существующая система борьбы с туберкулеза нуждается в модернизации. Ниже приведена информация о некоторых направлениях совершенствования его диагностики.

1

По имеющимся наблюдениям туберкулез развивается приблизительно у 10% людей, инфицированных M.tuberculosis, а в остальных случаях иммунная система не дает возможности патологическому процессу развиться и инфекция остается латентной. Как следствие одним из важнейших условий эффективного контроля туберкулеза служит выявление и устранение посредством химиотерапии такой формы инфекции. В настоящее время для ее диагностики применяют кожный тест, возможности которого ограничены низкой специфичностью. Поэтому на основании показаний данного метода инфекцию туберкулезных микобактерий нередко путают с поствакцинальным иммунным статусом и инфекциями нетуберкулезных микобактерий. В странах, где широко применяется вакцинация, этот недостаток проявляется особенно часто. Кожный тест имеет и ряд других отрицательных сторон, в т.ч. его показания зависят от дозировки туберкулина, вариабельности индивидуальной чувствительности к последнему, необходимостью пациента дважды посещать врача для постановки теста и учета его результатов.

Недавно появился новый метод диагностики латентного туберкулеза - QuantiFERON TB-2G , лишенный недостатков кожной пробы. Он основан на выявлении in vitro продукции гамма-интерферона лимфоцитами крови пациента. В качестве индукторов синтеза интерферона при его проведении пользуются антигенами ESAT-6 и CFP-10 M.tuberculosis. Эти антигены экспрессируют M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, но они отсутствуют у вакцинного штамма БЦЖ и большей части нетуберкулезных микобактерий, включая M. avium, M. intracellulare. Таким образом, достигается высокая специфичность показаний теста. Учет его результатов проводят не через 2 дня, как при кожной пробе, а на следующий день, причем автоматизация выявления интерферона повышает как чувствительность теста, так и объективность его показаний. Проведенные японскими специалистами из Исследовательского института туберкулеза испытания показали, что специфичность и чувствительность теста QuantiFERON TB-2G составляют 98,1 и 89,0%, соответственно. Тем не менее, до того, как начать его широкое применение необходимо установить сроки сенсибилизации иммунной системы людей разного возраста антигенами ESAT-6 и CFP-10 при туберкулезе [Harada N. Characteristics of a diagnostic method for tuberculosis infection based on whole blood interferon-gamma assay. Kekkaku, 2006, 81, 11, 681-686].

 2

Разработан метод наноиммунофлюоресценции, предназначенный для быстрого выявления туберкулезных бактерий в патологическом материале и культурах. Его проводят с применением силиконовых наночастиц c ковалентно иммобилизованным протеином А. По чувствительности он значительно превосходит флюоресцентный метод диагностики туберкулеза. Использование эпифлюоресцентного фильтра облегчает учет результатов теста и сокращает необходимые для этого затраты времени [Qin D., He X., Wang K., Zhao X.J. et al. Fluorescent Nanoparticle-Based Indirect Immunofluorescence Microscopy for Detection of Mycobacterium tuberculosis. J Biomed Biotechn, 2007, 89364, 1—9].

3

Серологическая диагностика туберкулеза весьма перспективна. Вариабельность антигенной структуры туберкулезных микобактерий на разных стадиях инфекционного процесса, наличие у него большого количества антигенов, вариабельная иммуногенность последних служат объективными причинами того, что до настоящего времени не разработано ни одного серологического теста, обладающего настолько высокой чувствительностью, чтобы им можно было бы заменить применяемые в настоящее время методы диагностики туберкулеза. Однако исследования в данном направлении активно ведутся во многих научных центрах мира. Одними из наиболее перспективных антигенов туберкулезных микобактерий для серологический диагностики туберкулеза человека, по мнению А. Вербона (Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды), являются секреторные антигены с молекулярной массой 24 и 38 кД, а также протеины теплового шока с молекулярной массой 12 и 16 кД. В настоящее время их с успехом испытывают для диагностики латентной формы туберкулеза в случаях, когда кожный тест, бактериоскопия патологического материала, а также тестирование в ПЦР дали отрицательные результаты. Выявление у обследуемых специфических антител позволяет начать лечение задолго до того, как будет поставлен окончательный диагноз на основании изоляции туберкулезных микобактерий [Verbon A. Development of a serological test for tuberculosis. Problems and potential.Trop Geogr Med, 1994, 46, 5, 275-279].

4

Антительный ответ на туберкулезные микобактерии при различных формах инфекции, а также у разных групп пациентов варьирует в широких пределах. Это диктует необходимость применения для серологической диагностики наборов антигенов туберкулезных микобактерий. С этой целью получены и испрытаны 3 рекомбинантных антигена M.tuberculosis (аналог протеина с молекулярной массой 38 кД, Ag16 и Ag85B). При исследовании сывороток крови больных туберкулезом, клинически здоровых инфицированных туберкулезными микобактериями, страдающих другими инфекционными и неинфекционными болезнями пациентов, а также здоровых людей в иммуноферментном тесте установили, что чувствительность и специфичность его проведения с отдельными из упомянутых выше антигенов варьирует в пределах 25-42 и 93-96% соответственно. Использование комплекса этих антигенов вело к повышению чувствительности иммуноферментного теста до 76% [ImazI M.S., María Fernanda SchmellingI; Susanne KaempferII et al. Serodiagnosis of tuberculosis: specific detection of free and complex-dissociated antibodies anti-mycobacterium tuberculosis recombinant antigens. Braz J Infect Dis, 2008, 12, 3].

5

 Размножение туберкулезных микобактерий в жидких питательных средах происходит значительно быстрее, чем на плотных. Однако идентифицировать изоляты, выделенные в первых значительно сложнее, чем в последних. Разработаны специально предназначенные для этого автоматизированные системы бульонного культивирования туберкулезных микобактерий (Bactec MGIT 960 и др.). Но они дороги и хотя сокращают срок бактериологического исследования, но все равно последний все еще остается большим. Кроме того, применение унифицированной среды (чаще всего Middlebrook-7H12) в таких системах ограничивает их возможности, поскольку она пригодна для культивирования далеко не всех штаммов туберкулезных микобактерий. Значительно быстрее обнаружить возбудителей туберкулеза удается ДНК-зондированием, но оно дорого и его проведение возможно лишь в специализированных центрах молекулярной диагностики.

Иммуннохроматографический тест, разработанный в ЮАР на основе антигена M.tuberculosis с молекулярной массой 64 кД, обладает высокими чувствительностью (97%) и специфичностью (100%), а также позволяет идентифицировать изоляты ТМБ в течение 15 мин. Стоимость теста низка, им могут пользоваться неквалифицированные сотрудники лабораторий [Ismail N.A., Baba K., Pombo D., Hoosen A.A. Use of an immunochromatographic kit for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis from broth cultures.Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13, 8, 1045-1047].

6

Инфекция туберкулезных микобактерий сопровождается выработкой иммунной системой организма человека большого количества специфических гетерогенных антител, что диктует необходимость применения для ее серологической диагностики "коктейля" антигенов туберкулезных микобактерий.

В Индии прошли испытания ускоренного иммунохроматографического теста, предназначенного для выявления в мокроте антител к 6 антигенам туберкулезных микобактерий. Показания теста оказались высокочувствительными и специфичными не только при моноинфекциях туберкулезных микобактерий, но также при их одновременном течение со СПИДом.

Диагностика смешанной инфекции туберкулеза и ВИЧ, осложнена тем, что ретровирусы подавляют клеточный иммунный ответ на чужеродные антигены. Тем не менее, при исследовании 200 проб мокроты таких пациентов в новом тесте получили положительную реакцию в 98% случаев, а специфичность его показаний составила 99%. Частота ложноположительных результатов не превышала 1%, а ложнонегативных — 2%. Комбинируя иммунохроматографический анализ с бактериоскопическим исследованием мокроты удалось выявить всех инфицированных туберкулезными микобактериями пациентов и исключить все неспецифические показания. Специалисты Госпиталя инфекционных болезней (г. Калькута, Индия) признали испытанный ими иммунохроматографический тест простым, быстрым и экономичным методом, позволяющим проводить скрининг большого количества проб мокроты в стационарно неблагополучных по туберкулезу районах [Chakraborty N., Bhattacharyya S., De C., Mukherjee A., Sarkar R.N., Banerjee D., Chakraborti S., Bhattacharyya S.K. A rapid immunochromatographic assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis antigens in pulmonary samples from HIV seropositive patients and its comparison with conventional methods.J Microbiol Methods, 2009, 76, 1, 12—17].

7

Быстрая и точная диагностика — непременные условия разрыва эпидемического процесса при туберкулезе. Этим определяется ключевая роль лабораторий в борьбе с этим опасным заболеванием. В Японии при ее проведении придерживаются рекомендаций CDC, которые регламентируют выявление кислотоустойчивых бактерий в течение 24 ч, идентификацию туберкулезных микобактерий в течение 21 дня и определение чувствительности изолятов к лекарственным препаратам в течение 30 дней после сбора патологического материала. Чтобы уложиться в такие сроки приходится прибегать к концентрированию проб патологического материала и их посевам на жидкие среды: из-за риска аэрозольного заражения персонала лабораторий эту работу проводят в ламинарных боксах класса II, и допускают к ней только высококвалифицированных специалистов.

Стандартным экспресс-методом идентификации изолятов туберкулезных микобактерий, растущих в жидких средах, в Японии признан иммунохроматографический тест Capilia TB. Попытки ускорить темпы диагностики туберкулеза в японских клиниках посредством применения молекулярно-генетических тестов (реакции амплификации и др.) пока не дали ожидаемого результата. На точность таких методов большое влияние оказывает процедура сборы мокроты. При определении лекарственной чувствительности изолятов туберкулезных микобактерий в настоящее время пользуются жидкой средой Огава [Takashima T, Higuchi T. Mycobacterial tests. Kekkaku, 2008, 83, 1, 43-59].

8

В связи с ростом инцидентности обнаружения в патологическом материале нетуберкулезных микобактерий проблема их дифференциации от ТМБ стала еще актуальнее. Проведено сравнение эффективности применения для этого иммунохроматографического (Capilia TB, TAUNS, Япония) и культурального (ProbeTec ET, Бектон Дикинсон, США) методов. Их чувствительность/специфичность при исследовании 183 проб мокроты, взятых от пациентов в госпитале Национального Тайского университета, составили 98,6/97,9 и 97,3/97,1%, а частота ложнопозитивных/ложнонегативных показаний – 2%/1% и 2%/2%, соответственно. Таким образом, оба теста проявили одинаковую диагностическую ценность, но иммунохроматографический тест позволял достичь тех же результатов в течение всего 15 мин и не требовал никакой аппаратуры [Wang J.Y., Lee L.N., Lai H.C., Hsu H.L., Jan I.S., Yu C.J., Hsueh P.R., Yang P.C. Performance assessment of the Capilia TB assay and the BD ProbeTec ET system for rapid culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis.Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 59, 4, 395—399].

9

 Ускоренный иммунохроматографический тест Dot assay позволяет диагностировать инфекцию нетуберкулезных микобактерий. Он основан на иммуноблоттинге и позволяет выявлять специфические антитела в сыворотке крови в течение 1 ч. Для его проведения не требуются валифицированные специалисты и специальная аппаратура. В качестве антигенов использованы фильтраты культур клинически значимых нетуберкулезных микобактерий (M.avium, M.kansasii, M.xenopi, M.chelonaei, M.scrofulaceum, M.marinum, M.fortuitum, M.abscesus и M.szulgai) и штамма H37Rv M.tuberculosis. В комбинации с клиническим и флюорографическим исследованиями тест позволяет исключать инфекции нетуберкулезных микобактерий [Stavri H., Brânaru-Gheorghiu M., Moldovan O., Raileanu M., Popa M.I., Popa L., Ene L.Rapid immunochromatographic serum assay of nontuberculous mycobacterial infections.Roum Arch Microbiol Immunol, 2005, 64, 1—4, 42—49].

10

 В Индустриальном исследовательском институте (г. Чиба, Япония) разработан комбинированный ПЦР-иммунохроматографический метод диагностики. При исследовании в нем и реакции амплификации 138 проб мокроты, взятых от больных туберкулезом и здоровых людей, установили, что новый тест высокоспецифичен, но недостаточно чувствителен [Suzuki T., Tanaka M., Otani S., Matsuura S., Sakaguchi Y., Nishimura T., Ishizaka A., Hasegawa N. New rapid detection test with a combination of polymerase chain reaction and immunochromatographic assay for Mycobacterium tuberculosis complex. Diagn Microbiol Infect Dis, 2006, 56, 3, 275—280].



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...

Критерии качества 2017: готовимся к оценке по-новому

Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно


Рассылка




Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль