Генетический полиморфизм: исследование пиросеквенированием

487

Под пиросеквенированием понимается современная технология, позволяющая определять нуклеотидные последовательности напрямую. Эта технология может использоваться как в обычной лаборатории медучреждения для решения диагностических задач, так и в научных организациях для решения задач, связанных с секвенированием.

пиросеквенированиеРассмотрим опыт использования этой технологии для исследований, которые направлены на изучение наследуемых генетических полиморфизмов и анализ полученных смесей ДНК.

Исследования генетического полиморфизма, который ассоциирован или связан с частными мультифакторными заболеваниями, могут быть впоследствии использованы в клинической врачебной практике.

Кроме того, в статье мы обсудим перспективы и уже существующие перспективы пиросеквенирования.

Общая информация о генетических полиморфизмах

Многие заболевания, которые связаны с нарушениями эндокринной, дыхательной, сердечно-сосудистой и других систем организма, являются мультифакторными.

Генетический полиморфизм в сочетании с другими неблагоприятными внешними факторами часто является главным фактором риска возникновения мультафакторных заболеваний.

Поэтому своевременное выявление генетических полиморфизмов, которые способны вызвать такие болезни, позволяет на раннем этапе выявить пациентов из группы риска, еще до проявления клинических симптомов, а также провести прогноз развития осложнений болезни.

Поэтому разработка новых методик и реагентов для определения значимых генетических полиморфизмов является ведущей задачей современной профилактической медицины.

Пиросеквенирование - способ выявления генетических полиморфизмов

пиросеквенированиеДля того, чтобы выявить генетические полиморфизмы в человеческом геноме, которые в большей части представлены однонуклеотидными заменами, принято использовать различные биологические и молекулярные методы.

В общем виде эти методы можно разделить на две группы: прямые и непрямые.

Прямой метод заключается в определении нуклеотидной последовательности изучаемых генетических локусов. Группа прямых методов на данный момент представлена разнообразными методами секвенирования ДНК, в частности, большое распространение получили разные варианты секвенирования по методу Ф. Сэнгера.

Выделяют также секвенирование параллельное и пиросеквенирование.

Непрямые методы представлены многообразными исследованиями: аллель-специфическая ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, ДНК-гибридизация, мини-секвенирование в сочетании с масс-спектрометрическим анализом и другие. Все эти методы не позволяют получить нуклеотидную последовательность в фрагментах ДНК.

В результате применения непрямых методов исследователь получает детектируемый сигнал, который может быть распознан как соответствующий генотип.

Выбор конкретного метода выявления генетического полиморфизма зависит от задач, поставленных перед исследователем, в том числе и от первичной последовательности анализируемой области, планируемого объема исследования и т.д.

Для того, чтобы выявить полиморфизм однонуклеотидный, достаточно произвести секвенирование лишь одного фрагмента ДНК, но использование метода Сэнгера или методов генетического анализа не всегда будет оптимальным вариантом.

Главные причины заключаются в длительной и сложной процедуре подготовке проб продуктов амплификации, в отсутствии специального программного обеспечения, которое позволило бы произвести автоматические подсчеты результатов определения генотипа в нужных локусах участка ДНК.

Поэтому самой удобной платформой для выявления однонуклеотидных полиморфизмов мы считаем использование прямых методов определения последовательностей в нуклеотидах, в частности, метод пиросеквенирования.

В научной литературе неоднократно описывался принцип данного метода, а также последовательность выполнения исследования, поэтому коротко остановимся на его сути.

При проведении реакции производится одновременный анализ всех комплементарных праймеру для реакции секвенирования, молекул ДНК, которые присутствуют в смеси для проведения реакции. При этом количество выделяемого в итоге пирофосфата пропорционально количеству нуклеотидов, которые встраиваются при синтезе ДНК.

Это создает возможность для дифференциации всех существующих генотипов исследуемого генетического локуса в количественном формате.

Она реализована с помощью программ для систем генетического анализа, которые позволяют также провести количественную оценку доли всех полиморфных нуклеотидов в интересующих локусах ДНК.

Клинические возможности технологии

Изучение многих результатов использования систем для проведения генетического анализа можно сделать вывод о том, что технология пиросеквенирования позволяет реализовать два типа исследования:

  • исследование, направленное на определение наследственного генетического полиморфизма в коротких фрагментах ДНК;
  • исследование, целью которого является анализ смесей ДНК, которые присутствуют в одном генетическом образце.

Возможности технологии были неоднократно опробованы для определения генетических полиморфизмов, что позволило разработать новые методики, позволяющие проводить следующие виды исследований:

  1. определение полиморфизмов однонуклеотидных (выявляется инсерция, делеция или замена нуклеотида) , а также одновременное определение генотипов для двух близко расположенных полиморфизмов. Также технология позволяет определить разные сочетания генотипов для некоторых полиморфизмов (например, для полиморфизма 2677T>A/G (rs2032582) в гене ABCB1);
  2. детекция делеций или инсерций в нескольких нуклеотидах, например определение мутации в гене BRCA1;
  3. определение количества повторов в генах, например количества ТА-повторов в гене UGT1A1.

Также технология пиросеквенирования позволяет производить анализ смесей ДНК в следующих исследованиях:

  1. количественная оценка и детекция соматических мутаций;
  2. исследование пулированных образцов ДНК для определения частот аллелей в группе больных.

Кроме того, в последних научных публикациях отмечается, что технология пиросеквенирования может быть использована для генотипирования и идентификации разных микроорганизмов.

Тесты, основанные на технологии пиросеквенирования и их применение

пиросеквенированиеС помощью рассматриваемой технологии в НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора были разработаны более 200 тестов для выявления разных генетических полиморфизмов.

Многие тесты собраны в группы по профилю генетического исследования для определения предрасположенности по наиболее частым мультифакторным болезням, а также выявления мутаций, которые могут быть связаны с наследственными формами рака и другими состояниями.

Значительная группа тестов посвящена фармакогенетическим исследованиям, которые направлены на выявление отклонений в генах, которые кодируют ферменты 1 и 2 фаз биотрансформации.

Технология пиросеквенирования позволяет провести стандартизацию анализа для разных однонуклеотидных полиморфизмов по одному протоколу, в профили исследований для тех или иных мультифакторных болезней может быть включено сразу несколько полиморфизмов. Также с помощью технологии можно проанализировать сочетание полиморфизмов, полученных из разных профилей, которые выбираются исследователем в зависимости от поставленных перед ним задач.

Так, при проведении фармакогенетических исследований, которые на сегодняшний день признаны одной из самых перспективных технологий персонализированной медицины, уже сегодня есть возможность комбинировать разные тесты для назначения тех или иных лекарств.

Многие профили уже активно используются на практике, и наиболее востребованными тестами на сегодня являются профили, которые объединяют полиморфизмы в генах, которые кодируют факторы свертываемости крови, а также в генетических локусах, ассоциированных с частыми мультифакторными заболеваниями.

Например, исследование генов, кодирующих плазменные факторы свертываемости крови, позволяет прогнозировать развитие потенциальных осложнений, которые связаны с тромбофилией, а также проводить профилактику их возникновения.

Приведем некоторые варианты исследований, которые уже востребованы

Наименование генов исследования полиморфизмов Цель исследования
  • MTHFR,
  • MTRR,
  • MTR,
  • SLC19A1
Полиморфизмы образуются в генах, связанных с метаболизмом фолиевой кислоты. Эти полиморфизмы могут привести к состоянию, которое связано как с нарушением системы свертывания крови, так и с разными патологическими состояниями в период беременности.
  • KCNJ11,
  • PPARG,
  • TCF7L2,
  • TCF7L2
Определение предрасположенности пациента к сахарному диабету 2-го типа.
  • BRCA1,
  • BRCA2,
  • 2080delA,
  • 4153delA
Выявления мутаций, которые способны привести к наследственным формам рака, например, рака молочной железы.
  • ADRB2,
  • AGT,
  • AGTR1
Определение предрасположенности к артериальной гипертензии.

Фармакогенетическое исследование в генах

  • VKORC1,
  • CYP4F2,
  • GGCX
Определение терапевтической дозы варфарина. Кроме того, помощью исследования полиморфизмов в этих генах можно также определить индивидуальный фармакологический ответ на другие лекарства.

Перспективы пиросеквенирования

Кроме уже названных преимуществ, которое дает технология пиросеквенирования, можно назвать и перспективные направления.

Так, пиросеквенирование является удобным методом для валидации непрямых методов определения однонуклеотидных полиморфизмов. Уже разрабатываются исследования для выявления генетической предрасположенности к возникновению ишемического инсульта, а также мутаций, которые могут привести к наследственному гемохроматозу.

Все возможности, которые непосредственно связаны с анализом смесей фрагментов ДНК на протяжении нескольких десятков пар оснований, позволят технологии пиросеквенирования в перспективе количественно определять известные соматические мутации, а также выявлять новые.

Системы генетического анализа в последние годы активно совершенствуются, и основной упор зарубежные компании делают на полную автоматизацию процедуры пробоподготовки.

Также активно ведется разработка систем генетического исследования с дополнительными картриджами для реакционных смесей, что позволит проводить параллельное определение нескольких нуклеотидных последовательностей в одном генетическом образце.

Другое направления совершенствования заключается в том, чтобы полностью обновить продукты программного обеспечения и изменить реагенты, которые используются для синтезирования ДНК.

Разработчики уже заявляют о масштабных обновлениях и добавлении новых опций, которые позволят значительно улучшить качество и увеличить длину сиквенсов. Это имеет большое значение при проведении анализа неизвестных или гипервариабельных локусов ДНК.

На сегодня все оборудование для проведения метода пиросеквенирования представляет собой открытую сеть, поэтому существует вероятность расширения спектра анализируемых генетических тестов, а также профилей для проведения генетических исследований.

В последнее время очень много говорится о разработке новых тестов для выявления генетических полиморфизмов, что обусловлено получением новой информации о роли генетических факторов в формировании тех или иных состояний и заболеваний. Информация эта может быть успешно использована для своевременного проявления профилактических и диагностических мероприятий в клинической практике.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×