Влияние преаналитического этапа на результат бак посева из цервикального канала

377

Изучение состава шеечной слизи дает возможность определить роль цитокинов в диагностике воспалительных процессов у пациенток с эктопией шейки матки.

Преаналитический этап данного исследования является крайне важным, так как именно от способа забора биологического материала зависит его окончательный результат. Стандартизация преаналитического этапа позволяет осуществлять индивидуальное наблюдение за активностью изменений на эпителии шейки матки у женщин с эктопией

Изучение состава содержимого цервикального канала в последние годы дало возможность:

  1. определить роль цитокинов в развитии механизма противоинфекционной резистентности генитального тракта и диагностики воспалительных процессов у пациенток с эктопией шейки матки;
  2. оценить противоинфекционную и противоопухолевую резистентность локального иммунного ответа женского генитального тракта.

Комплекс лабораторных исследований, способствующий большей эффективности лечения патологий шейки матки и решению вопросов стандартизации назначения иммуномодулирующих препаратов, позволяет оптимизировать изучение параметров местного иммунного ответа. Это, в свою очередь, дает возможность проводить лечение пациенток с учетом индивидуальных особенностей их заболевания. 

Влияние способов мазка на результаты анализа

Известно, что хронические воспалительные процессы, избыточное разрастание тканей и злокачественное перерождение клеток эпителия шейки матки тесно связаны с недостаточностью и дисбалансом местной иммунной реакции. Слизистая шейки матки постоянно подвергается воздействию неблагоприятных внешних факторов, наиболее агрессивными из которых являются условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Вследствие усиления выработки клетками иммунной системы человека провоспалительных цитокинов, проникающих в очаг воспаления (Т-хелперы, естественные киллеры, мононуклеарные фагоциты), постоянно запускается местная иммунная реакция.

За счет лимфоидной гистиоцитарной инфильтрации с примесью гранулоцитов, нейтрофилов, плазмоцитов и наполнения сосудов кровью происходит усиление выработки слизистого секрета шейки матки с отторгшимися, подвергшимися дистрофической трансформации эпителиальными клетками и продуктами распада воспаленных тканей.

Бак посев из цервикального канала - влияние преаналитического этапаВсе это приводит к изменению выделения медиаторов воспаления, что в результате и становится причиной перерождения клеток эпителия и развития онкологической патологии шейки матки.

Сегодня опубликовано много научных работ об изучении состава цитокинов при заболеваниях шейки матки. Однако единого метода забора материала и его последующей аналитической обработки до сих пор не выработано. В связи с этим результаты анализа уровня цитокинов в секрете цервикального канала имеют существенные различия у разных авторов, несмотря на использование комплекса реагентов для твердофазного ИФА с одинаковым диапазоном величин определяемых показателей.

Анализ методик исследования уровня цитокинов, использованных разными авторами, показал, что наибольшее значение имеет способ, которым проводится мазок из цервикального канала. Самые низкие показатели уровня цитокинов были у авторов, производивших забор отделяемого цервикального канала пинцетом или ложкой Фолькмана на глубине 2 см от экзоцервикса. Материал разводился в физрастворе к пропорции 1:1. Для проведения анализа применяли комплект реагентов фирмы ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Самые высокие показатели представлены у авторов, производивших забор цервикального секрета при помощи универсального зонда. Материал помещали в пробирку с 1 мл буферного раствора. Затем производилась экстракция путем встряхивания на вортексе в течение 1 минуты. Проученная смесь центрифугировалась при 900 g в течение 5 минут.

Надосадочную жидкость отделяли, замораживали и хранили при температуре 80ºС до проведения анализа. Далее определяли в слизи цервикального канала содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения анализа также использовали комплект реагентов фирмы ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Авторы, получившие средние значения, применяли для забора цервикальной слизи урогенитальный зонд. Полученный материал помещали в пробирку с физраствором в концентрации 0,155 М, в результате чего можно было получить разведение слизи 1:200. Полученные образцы тестировались при помощи метода ИФА Определение количества цитокинов в образцах осуществлялось с применением комплекта реагентов фирмы «Вектор-Бест».

Таким образом, преаналитический этап исследования уровня цитокинов в шеечном секрете играет огромную роль в интерпретации полученных результатов (диапазон определяемых уровней показателей в биологических жидкостях: ИЛ-8 — от 0 до 250 пг/мл, ИЛ-6 — от 0 до 300 пг/мл, ИЛ-1β — от 0 до 250 пг/мл).

Забор цервикальной слизи для исследования концентрации цитокинов

Подготовка и проведение анализа (набор реагентов ЗАО «Вектор Бест»):

В исследовании принимали участие 49 пациенток в возрасте от 20 до 40 лет, в числе которых 21 женщина с впервые выявленной эктопией шейки матки, 18 женщин с рецидивом данного заболевания,  а также 10 женщин без патологических изменений шейки матки (контрольная группа).

Преаналитический этап исследования включал в себя следующие мероприятия:

  • удаление лишних выделений;
  • обработка шейки матки и стенок влагалища стерильным физраствором;
  • забор цервикальной слизи при помощи урогенитального зонда;
  • разведение цервикальной слизи в 0,155 М растворе NaCl до получения концентрации 1:200;

Для того, чтобы удалить лишние выделения, область, подлежащую исследованию, осторожно очищали стерильным ватным тампоном.

Для того, чтобы произвести бак посев из цервикального канала, применяли мягкий урогенитальный зонд, который вводили в цервикальный канал на глубину не менее 2 см и поворачивали дважды в одну и в другую сторону. Установлено, что для полного пропитывания зонда необходимо 0,05±5 мг цервикальной слизи.

Пропитанный цервикальной слизью урогенитальный зонд переносили в пробирку типа Эппендорф с 1000 мкл раствора NaCl и встряхивали ее при помощи центрифуги-вортекса СМ 70М-07 на протяжении 10 минут и получали отделяемое цервикального канала в концентрации 1:200. Полученные образцы заморозили при -40 ºС и хранили до момента проведения анализа.

Для обработки полученных данных использовали стандартные статистические методы и программное обеспечение Microsoft Office Excel, а также пакет прикладных программ для научно-технических вычислений Statistica v6.0, Microsoft Office Excel 2007. Применялись методы непараметрической статистики.

Критерием достоверности между двумя независимыми группами выступил непараметрический критерий Манна-Уитни, а также тест Вилкоксона. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха для непараметрических переменных.

Для оценки диагностических характеристик исследуемого маркера использовался анализ кривой ROC (площадь под кривой ROC не отличается от величины 0,5), который предусматривает сравнение основных операционных характеристик теста – специфичности и чувствительности. Пороговые значения биомаркера определялись при построении графиков зависимости вышеуказанных операционных характеристик от концентрации биомаркера в секрете цервикального канала.

Результаты проведенного анализа наглядно показывают, что в шеечном секрете пациенток как с впервые выявленной эктопией шейки матки, так и с рецидивом заболевания отмечаются высокие уровни всей группы провоспалительных цитокинов.

Расшифровка анализа на цитологию шейки матки

Уровень цитокинов в отделяемом цервикального канала у обследованных женщин

Группа обследованных

Медиана концентрации цитокинов, пг/мл (25–75 процентиль)

ИЛ-1β, нг/мл

ИЛ-6, нг/мл

ИЛ-8, нг/мл

ИЛ-10, нг/мл

Контрольная группа

8,3* (2,6; 22,2)

15,6* (4,7; 43,3)

102,9* (21,7; 173,3)

7,1 (3,2; 9,9)

Женщины с рецидивирующим течением эктопии шейки матки

104,6* (26,8; 378,4)

327,5* (139,5; 484,9)

312,8* (287,5; 329,4)

11,7* (7,0; 22,0)

Женщины с впервые выявленной эктопией шейки матки

102,4* (25,8; 418,8)

428,1* (106,4; 953,1)

281,0* (150,9; 325,2)

9,0 (2,4; 15,7)

* Р ≤ 0,05 по сравнению с контрольной группой.

Интерпретация результатов исследования бак посева

Цитология мазка из цервикального канала, расшифровка результатов которой позволяет сделать однозначные выводы:

  1. уровень провоспалительного цитокина ИЛ-1β у женщин с впервые диагностированной эктопией шейки матки и с рецидивом заболевания в 12 раз выше, чем у пациенток в контрольной групп;.
  2. содержание ИЛ-6 у пациенток с первичным выявлением эктопии шейки матки в 27 раз выше, чем у здоровых женщин из контрольной группы, а у пациенток с рецидивом заболевания данный показатель выше в 20 раз (ИЛ-6 является регулятором процесса созревания антител, а также отвечает за продукцию лимфоцитов и иммуноглобулинов, поэтому он принимает участие в остром воспалительном процессе у пациенток с патологиями шейки матки);
  3. концентрация ИЛ-8 в обеих группах пациенток с патологией шейки матки в 2,5-3 раза выше, чем у здоровых женщин, что говорит об активации нейтрофилов стромы шейки матки в ответ на внешнее раздражение компонентами бактериальной стенки (ИЛ-8 – мощный хемокин, обеспечивающий перемещение Т-клеток, эозинофилов, моноцитов и нейтрофилов в очаг воспаления, и высокое его содержание можно объяснить присутствием во влагалище здоровых женщин условно-патогенной микрофлоры, взаимодействующей с местным иммунитетом).
  4. Концентрация ИЛ-10 у пациенток с эктопией шейки матки выше, чем у здоровых пациенток, в среднем в 1,2-1,6 раза, что говорит о действии механизма «уклонения» инфекционных агентов от местного иммунитета, представленного в первую очередь фагоцитами.

Исследование ROC-кривых и вычисление пороговых значений показали, что подъем содержания в цервикальном содержимом ИЛ-1β до 62,4 нг/мл, ИЛ-6 до 437,7 нг/мл, ИЛ-8 до 310,7 нг/мл подтверждает наличие в области шейки матки очага острого воспаления. Это значит, что указанные биологические маркеры являются индикатором наличия воспаления.

У ИЛ-10 в цервикальной слизи значения площади под кривой ROC достоверно не отличаются от 0,5 – это значит, что данный маркер не имеет существенной диагностической значимости у женщин, принимавших участие в исследовании.

Высокие концентрации провоспалительных цитокинов в отделяемом цервикального канала демонстрируют перспективности исследования основных провоспалительных цитокинов как показателей локального очага воспаления в тканях шейки матки, включая эпителиальную выстилку. При этом изменение величин трех видов провоспалительных цитокинов шеечной слизи в диапазоне значений:

  • ИЛ-1β от 30,6 до 62,4 нг/мл;
  • ИЛ-6 от 74,8 до 437,7 нг/мл;
  • ИЛ-8 от 189,2 до 310,7 нг/мл н

наглядно показывают индивидуальный характер найденных изменений.

Предложенная в данной статье стандартизация преаналитического этапа исследования отделяемого цервикального канала дает возможность осуществлять индивидуальное наблюдение за активностью воспалительных изменений на шейке матки с эктопией при текущем контроле женщин.

Данная методика также подходит для выявления признаков хронизации воспаления, а также может быть использована при определении мишени для индивидуальной терапии и оценки ее эффективности.                      

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×