Бактериологический метод исследования, критерии оценки

208

Бактериологический метод исследования доступен в большинстве КЛД, применяется к лицам всех возрастов и позволяет обнаружить качественные и количественные сдвиги в состоянии кишечной микрофлоры для их своевременной коррекции, выявления и предупреждения патологических изменений в состоянии здоровья человека.

Микробиоценоз кишечника – это высокочувствительная индикаторная система, реагирующая на изменения состояния здоровья человека различными качественными и количественными сдвигами.

Многие ученые на сегодняшний момент придерживаются мнения, что кишечная микрофлора является основным показателем внутреннего здоровья человека.

Различными исследованиями доказано существование сложной многоуровневой системы симбиотических взаимоотношений между популяциями микроорганизмов и клетками организма-хозяина. При различных патологических состояниях кишечная микрофлора меняет свой состав и свойства, в результате чего нарушается важнейшие функции организма. Изменения микрофлоры кишечника называются дисбиозами, дисбактериозами и дисбиоценозами.

Оценку состояния кишечной микробиоты проводят при помощи методики, за основу которой взят бактериологический метод исследования.

Бактериологический метод исследования: нормативная база

В ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» термин «дисбактериоз» трактуется как клинико-лабораторный синдром, который в первую очередь связан с качественным или количественным изменением состава кишечной микробиоты, в результате чего возможны дальнейшие метаболические и иммунологические расстройства. Данный стандарт является основным нормативным документом при оценке состояния микробиоценоза кишечника.

В нем приводятся таблицы, которые наглядно показывают состав кишечной флоры здорового человека, а также определены критерии диагностики дисбиозов.

К сожалению, в данном документа, как и в ряде других ему подобных, отсутствует методика проведения исследования, хотя именно от нее зависит спектр микроорганизмов, которые могут быть выделены из микробиоты пациента для дальнейшей идентификации их рода и вида. В отечественной медицинской практике широко используется бактериологический метод диагностики, направленный в первую очередь на обнаружение аэробных микроорганизмов, в то время как анаэробные бактерии выделяются при помощи полуколичественного способа, предполагающего определение количества микробов с учетом разведения биоматериала.

Подсчет колоний и видовая идентификация при этом не производятся, так как микроорганизмы выращиваются на жидких и полужидких питательных средах. Как правило, это касается лакто- и бифидобактерий. В привычной практике определение рода этих микроорганизмов проводится лишь по их морфологическим признакам, а это делает невозможной их дифференциацию с эубактериями, пропионобактериями и другими грамположительными микроорганизмами.

Это не касается отдельных методов, которые дают возможность дополнительно идентифицировать бактероиды и клостридии при помощи питательных сред собственного приготовления, а также методов, привязанных к питательным средам конкретного производителя.

Большинством методик исследования не предусмотрено выделение и определение фузобактерий и эубактерий, хотя, согласно ОСТ 91500.11.0004-2003, их содержание в микробиоте здорового человека не должно превышать строго определенных значений.

Таким образом, в вышеуказанном отраслевом стандарте приводятся обобщенные данные различных авторов о составе кишечной микробиоты, которые были получены путем использования различных методик, в то время как унифицированный стандартный метод изучения количественного и качественного состава флоры толстого кишечника не предложен.

Методика проведения бактериологического анализа

За основу предлагаемой методики количественного и качественного состава кишечной микробиоты был выбран традиционный бактериологический метод диагностики, разработанный Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской. Его суть состоит в мерном посеве разведений субстрата (фекалий) в физрастворе в пропорции 1:10 на дифференциально-диагностические среды.

Это дает возможность выделения чистых микробных культур и определения количества каждой из них в 1 грамме биоматериала.

Исследуемый биологический материал (кал) собирают в стерильную и предварительно взвешенную емкость без добавления консерванта в количестве около 1 грамма, и доставляют в клинико-диагностическую лабораторию не позднее 203 часов с момента взятия. Это крайне важно для выделения анаэробных микроорганизмов, которые погибают под воздействием кислорода.

Вес материала, взятого на исследование, определяется по разнице веса пустого флакона и флакона с калом. Для приготовления десятикратного разведения требуемый объем фосфатного буфера по Хенелю или физраствора определяют по приведенной ниже таблице.

Таблица 1

Пересчетная таблица

Вес, мг

Кол-во физ. р-ра, мл

Вес, мг

Кол-во физ. р-ра, мл

Вес, мг

Кол-во физ. р-ра, мл

Вес, мг

Кол-во физ. р-ра, мл

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390

1,80 1,89 1,98 2,07 2,16 2,25 2,34 2,43 2,52 2,61 2,70 2,79 2,88 2,97 3,06 3,15 3,24 3,33 3,42 3,51

400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590

3,60 3,69 3,78 3,87 3,96 4,05 4,14 4,23 4,32 4,41 4,50 4,59 4,68 4,77 4,86 4,95 5,04 5,13 5,22 5,31

600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 790

5,40 5,49 5,58 5,67 5,76 5,85 5,94 6,03 6,12 6,21 6,3 6,39 6,48 6,57 6,66 6,75 6,84 6,93 7,02 7,11

800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

7,20 7,29 7,38 7,47 7,56 7,65 7,74 7,83 7,92 8,01 8,10 8,19 8,28 8,37 8,46 8,55 8,64 8,73 8,82 8,91 9,00

Подсчет количества каждого вида микробов в 1 грамме биологического материала проводят по числу колоний, которые выросли на питательных средах, в пересчётом на количество посевного материала и степень его разведения по формуле:

М = Р × 2 × 10n+1,

где М – число микробов в 1 г исследуемого материала, Р – число колоний, n – разведение, 2 – коэффициент при посевном объеме 0,05 мл.

При проведении посева 1 мл материала из разведений подсчет числа бактерий в грамме определяется по формуле М = Р × 10n.

Обязательным условием достоверного количества отдельных групп микробов является получение изолированных колоний.

Выбор питательных сред

Предложенный бактериологический метод диагностики не имеет привязки к питательным средам того или иного производителя, что дает возможность применения любых питательных сред, аналогичных по накоплению, а также дополнительных сред, дающих возможность выделения и идентификации до рода и вида требуемый спектр микроорганизмов, транзиторной, облигатной или факультативной флоры. В Таблице 2 приведен рекомендуемый перечень сред для первичного посева и подробные комментарии и к данной методике.

Таблица 2

Схема бактериологического исследования микробиоценоза кишечника

Наименование среды

Разведение

Количество, мл

Условия инкубации

Назначение среды

анаэробные/ аэробные

Т °С

время, ч

Среда обогащения: селенитовый бульон или магниевая среда, забуференная пептонная вода (Buffered peptone water, М614 HiMedia)

10-1

1,0

Аэробные

37

18–24

Среды обогащения для бактерий рода Shigella, Salmonella

Среда Плоскирева

Со среды обогащения

Посев петлей

Аэробные

37

18–24

Обнаружение бактерий рода Shigella

Висмут-сульфитный агар

Со среды обогащения

Посев петлей

Аэробные

37

24–48

Обнаружение бактерий рода Salmonella

Гектоеновый энтеро-агар (Hektoen Enteric Agar, М467 HiMedia)

Со среды обогащения

Посев петлей

Аэробные

37

24–48

Обнаружение бактерий родов Salmonella, Shigella

Среда Плоскирева

10-1

Посев петлей

Аэробные

37

18–24

Обнаружение бактерий родов Shigella, Salmonella, условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

10-4

0,05

Аэробные

37

18–24

Выделение и подсчет колоний бактерий родов Shigella, Salmonella, а также Klebsiella, Citrobacter, Hafnia, Proteus и других условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, а также неферментирующих грамотрицательных бактерий

Среда Эндо

10-5

0,05

Аэробные

37

18–24

Выделение и подсчет колоний типичных и атипичных E. coli, отбор колоний для проведения агглютинации с поливалентной сывороткой ОКА для выявления возбудителей эшерихиозов, а также выделение и подсчет колоний др. условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий

5% кровяной агар

10-5

0,05

Аэробные

37

18–24

Выделение и подсчет гемолитических форм E. coli, Enterococcus. Выделение и подсчет колоний бактерий рода Staphylococcus

Желточно-солевой агар. Основа агара Бэрда – Паркера (Baird Parker Agar Base), добавка с теллуритом калия и эмульсией яичного желтка М 1468, FD 046 HiMedia

10-3

0,05

Аэробные

37

48

Выделение и подсчет колоний бактерий рода Staphylococcus, определение лецитиназной активности

Агар по Вогелу – Джонсону (Vogel – Johnson Agar Base М 023, HiMedia)

10-3

0,05

Аэробные

37

48

Выделение и подсчет колоний коагулазо- и маннитположительных бактерий рода Staphylococcus

Среда Сабуро

10-1 10-3

0,1

Аэробные

22–25

До 7 суток

Выделение и подсчет колоний грибов рода Candida

Висмут-сульфит-глюкозо-глицино-дрожжевой агар – среда Никкерсона (Bi.G.G.Y. Agar М 217, HiMedia),

Высокоселективная среда для выделения и предварительной идентификации Candida albicans и Candida tropicalis

ХайКром селективный агар для грибов Candida (HiCrom Candida Agar М1297А/М1456А, HiMedia)

Хромогенная среда. Применяется для селективного выделения и идентификации в первичном посеве Candida albicans, С. krusei, С. glabrata, C. tropicalis

Среда Блаурокка, бифидум-среда ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (г. Оболенск), агар для бифидобактерий, модифицированная селективная среда Bifidobacterium agar, М1396, HiMedia

10-5–10-9

1,0

Анаэробные

37

72

Определение количества бактерий рода Bifidobacterium

Среда МРС-2 НИЦФ (г. Санкт-Петербург)

10-5–10-9

0,05

Микроаэро- фильные

37

24–72

Определение количества бактерий рода Lactobacillus

Среда МРС-4 НИЦФ (г. Санкт-Петербург), Лактобакагар ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (г. Оболенск)

10-5, 10-6

0,05

Анаэробные

37

24–72

Выделение и определение количества бактерий рода Lactobacillus

ЖСС агар ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (г. Оболенск), агар для выделения клостридий (Clostridial agar М 497, HiMedia), агар Шадлера М291, HiMedia, агар по Вилкинсу – Чалгрену М832, HiMedia

10-1, 10-3, 10-4

1

Анаэробные

37

24–48

Выделение и определение количества бактерий рода Clostridium

2% кровяной агар с добавлением дрожжевого автолизата, твин-80 и аскорбиновой кислоты, агар для бактероидов с желчью и эскулином (Bacteroides Bile Esculin Agar) + селективная добавка для бактероидов М 805 FD 062, HiMedia, агар Шадлера М291, HiMedia, агар по Вилкинсу – Чалгрену М832, HiMedia

10-5, 10-7–10-9

0,1

Анаэробные

37

24–48

Выделение и подсчет бактерий группы Bacteroides fragilis

2% кровяной агар с добавлением дрожжевого автолизата, твин-80 и аскорбиновой кислоты, среда Фогета – Фредетта с добавлением 0,4% агара М431, HiMedia, агар Шадлера М291, HiMedia

10-1, 10-3, 10-4

1

Анаэробные

37

24–48

Выделение эубактерий, фузобактерий, пептококков, пептострептококков

Бактериологический метод диагностики обладает неоспоримым достоинством, коим является наиболее точная верификация полученных данных за счет выделения чистых микробных культур. Кроме того, он доступен для клинико-диагностических лабораторий практически любого уровня оснащения и может быть использован для изучения состояния флоры кишечника у лиц разного возраста.

Но данный метод имеет и ряд недостатков. К ним относятся, например,:

  • дороговизна питательных сред;
  • длительность получения результатов.

Однако при использовании бактериологических анализаторов автоматического типа время получения первых результатов может быть сокращено до 2 суток.

Исследование кишечной микробиоты: критерии оценки

Учеными из Лаборатории Микробиома человека и средств его коррекции ФБУН ННИИЭМ имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора была изучена кишечная микрофлора 3268 «здоровых» и «больных» людей. В каждой возрастной группы были выделены критерии оценки здоровья для разделения по категориям «здоровых» и «больных».

Таблица 3

Объем исследований

Возраст

Количество обследованных

«здоровые»

«больные»

всего

24 ч – 6 сут

280

337

617

7–29 сут

180

178

358

1–11 мес.

245

290

535

1 год – 6 лет

209

235

444

7–17 лет

192

203

395

18–59 лет

236

234

470

От 60 лет и старше

180

269

449

Итого

1522

1746

3268

После обобщения полученных результатов исследования выяснилось, что у «здоровых» лиц разного возраста имеются изменения видовой структуры микрофлоры толстого кишечника, которые характерны для определенных возрастных групп. По этой причине адекватная оценка состояния кишечной микробиоты потребовала разделения каждой из ранее выделенных возрастных групп – 0-1 год и 1-60 лет – на три подгруппы:

  • 0 – 1 год:
  • 24 часа – 6 суток;
  • 7 суток – 29 суток;
  • 1 месяц – 11 месяцев;
  • 1 – 60 лет:
  • 1 год – 6 лет;
  • 7 лет – 17 лет;
  • 18 лет – 59 лет.

На основании проведенного анализа была составлена сводная таблица количественного и качественного состава микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей.

Таблица 4

Качественный и количественный состав микробиоценоза толстого кишечника

у здоровых людей (КОЕ/г фекалий)

№ п/п

Показатели

Возраст

24 ч – 6 сут

6–29 сут

1–11 мес.

1–6 лет

7–17 лет

18–59 лет

60 лет и старше

Bifidobacterium spp.

102–109

107–1010

108–1011

108–1011

108–1011

107–1010

107–109

Lactobacillus spp.

103–108

108–109

107–1011

107–109

107–1011

107–109

107–109

Lactococcus lactis

102–108

Нет

107–1010

107–109

109–1011

107–109

108–109

Clostridium spp. и другие анаэробные микроорганизмы*

Нет

Нет

104–106

104–106

105–106

105

107

Bacteroides spp.**

Нет

Нет

105–106

107–108

107–108

107–108

107–108

E. coli лактозопозитивные

103–109

107–108

107–109

107–109

106–108

106–109

107–108

E. coli лактозонегативные

<105

<105

<106

<105

<105

<105

<105

E. coli гемолитические

Нет

Нет

<105

<105

<105

<105

<105

E. coli (общее количество)

103–109

107–108

107–109

107–109

106–108

106–109

107–108

Enterococcus spp.

104–106

104–107

105–108

106–108

107–108

107–108

106–108

S. epidermidis

<105

<105

<105

<105

<105

<104

<104

S. aureus

<104

<104

<105

<104

<104

Нет

Нет

Оппортунистические микроорганизмы (условно-патогенные микроорганизмы) семейства Enterobacteriaceae

<105

<105

<105

<105

<105

<105

<105

Неферментирующие грамотрицательные бактерии, в том числе P. aeruginosa

Нет

Нет

<104

<105

<105

<105

<105

Дрожжеподобные грибы рода Candida

<104

<104

<104

<104

<104

<104

<104

Salmonella spp.

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Shigella spp.

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

E. coli энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтерогемморагические, уропатогенные

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

* Выделяются начиная с возраста 9–11 мес.

** Выделяются начиная с возраста 7–8 мес.

Зачастую из-за сложности интерпретации результатов бактериологического метода диагностики различных нарушений при дисбактериозе врачи пользуются приведенной выше таблицей, ошибочно принимая представленные значения за норму и занося их в бланк результатов микробиологических исследований. В связи с этим отсутствует учет количественного соотношения аэробных и анаэробных микроорганизмов. Целесообразнее в этом случае использовать оценку состояния кишечной флоры, основанную на комплексном подходе. Она проводится как с позиции количественной представленности отдельных видов бактерий, так и с позиции отношения аэробов к анаэробам.

Таблица 5

Классификация дисбиоза по степени выраженности бактериологических показателей

Признаки

Слабо выраженный дисбиоз кишечника (I степени)

Выраженный дисбиоз кишечника (II степени)

Резко выраженный дисбиоз кишечника (III степени)

«Анаэробы»* анаэробы и микроаэрофилы

Соотношение аэробной и анаэробной флоры

Преобладает анаэробная флора

Соотношения равные

Преобладает аэробная флора

Наличие бифидобактерий

107–108

Чаще присутствует один из родов Bifidobacterium или Lactobacillus 106–107

Отсутствуют бактерии родов Bifidobacterium или Lactobacillus или резко угнетены (105 и менее)

Наличие лактобактерий

107–108

Наличие бактероидов***

105–108

105–107

105–107

Наличие клостридий**

104–107

104–107

104–107

«Аэробы» аэробы и факультативные анаэробы

Наличие E. coli

106–107

106–107

104–109

Наличие условно-патогенных микроорганизмов, в том числе гемолитических E. coli и E. coli со сниженной ферментативной активностью

Наличие 1–2 видов условно-патогенных микроорганизмов в количестве до 105–106 ****

Наличие ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов по 3 вида и более в количествах 105–107 или один вид в количестве 105–107*****

Наличие ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов по 3 вида и более в количествах 105–108 или один вид в количестве 105–107*****

 * Объединены анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы (лактобациллы).

** Выделяются начиная с возраста 9–11 мес.

*** Выделяются начиная с возраста 7–8 мес.

**** У детей от 1 мес. до 1 года ассоциации по 3–4 вида [23].

***** Необходимо проводить дифференциальную диагностику при оценке результатов между дисбиозом и кишечной инфекцией, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, в частности пищевой токсикоинфекцией.

В заключение стоит сказать, что оценка состояния микробиоты толстого кишечника только с точки зрения нормы для отдельных родов и видов бактерий способна, с одной стороны, привести к гипердиагностике, а с другой – опасна пропусками опасных кишечных инфекций, в том числе и пищевых токсикоинфекций и госпитальных заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами. 

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...






      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×