Методика определения антител к основным возбудителям TORCH-групп

205

Авторами разработана методика определения антител к основным возбудителям TORCH-группы в формате линейного иммуноблоттинга. При исследовании 141 образца аттестованного контрольного материала промышленного производства показаны 100% чувствительность и специфичность исследований предложенной методики.

Для определения чувствительности и специфичности методики в соответствии требованиями ГОСТ Р 53022.3-2008 определена ее клиническая информативность.

Исследование образцов крови, полученных у беременных и лиц, проходивших диагностическое обследование, продемонстрировало более высокие показатели клинической информативности выявления специфических АТ методом линейного иммуноблоттинга по сравнению с иммуноферментным анализом. 

Благодаря комплексу мероприятий общественного здравоохранения в Российской Федерации в последние годы наблюдается устойчивое снижение показателей младенческой смертности. Так, по официальным данным Федеральной службы государственной статистики (Росстат), в 2014 г. показатель относительной смертности детей в возрасте до одного года составил 7,4 случая на 1000 новорожденных против 8,2 – в 2013 г. (снижение на 9,8%).

В структуре причин, обусловливающих перинатальную гибель плодов и новорожденных, существенную роль играют внутриутробные или врожденные инфекции (ВУИ), развивающиеся в результате анте- или интранатального инфицирования плода при вертикальном (трансплацентарном) пути передачи инфекционного агента от матери [2–4, 13, 15, 18–20].

Актуальность изучения проблемы ВУИ обусловлена не только существенными пери- и постнатальными потерями, но также и тем, что у новорожденных, перенесших ВУИ на ранних этапах гестации, часто определяется патология развития, приводящая к серьезным нарушениям здоровья и инвалидности.

Установлено, что проникновение возбудителя инфекции в организм плода на ранних этапах его развития приводит к нарушениям правильной закладки тканей и систем органов и формированию в поврежденных органах фиброзно-склеротических трансформаций, в то время как ВУИ в поздний фетальный период чаще сопровождаются воспалительным повреждением отдельных органов и систем или генерализованным поражением [1–3, 14, 15, 21].

Истинная частота распространенности ВУИ до настоящего времени не установлена, по данным отдельных научных исследований, она может составлять 6–10% [2, 13, 20], в отдельных регионах достигать 22,6% [1, 3, 15, 18, 20] и даже 53% [5].

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

Лабораторная диагностика

Развитие ВУИ плода не обязательно проявляется в виде манифестных форм при рождении или в ближайший неонатальный период, при этом отмечается, что у новорожденных клинические проявления ВУИ не имеют специфических признаков, что затрудняет их этиологическую диагностику.

Указанное обстоятельство привело к тому, что наиболее значимые ВУИ с позиций тяжести поражения плода и новорожденного были объединены в общую группу.

Для обозначения этой патологии был предложен термин «TORCH-инфекции» – аббревиатура латинских наименований основных заболеваний (Тoxoplasmоsis, Rubella, Cytomegalia, Herpes и Оther infections); в разряд «другие» специалисты включают широкий круг инфекций, увеличивающийся с развитием знаний о них: сифилис, листериоз, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекцию, хламидиоз, микоплазмоз и другие [2, 5, 14, 19, 21].

Скудность клинической симптоматики и отсутствие специфицирующих признаков у TORCH-инфекций способствовали привлечению лабораторных методов для их выявления и верификации этиологических факторов.

При обследовании беременных и новорожденных приоритет получили косвенные методы лабораторной диагностики TORCH-инфекций, направленные на выявление в крови маркеров специфического иммунного ответа (антител) и оценку динамики их концентрации [6–12, 17]. Для обнаружения и количественной оценки специфических АТ используют преимущественно иммуноферментный анализ (ИФА) и линейный иммуноблоттинг (ЛИБ).

Преимуществом применения технологии иммуноблоттинга является возможность оценки присутствия специфических АТ к отдельным иммунокомпетентным антигенам одного или нескольких возбудителей инфекций при проведении одного лабораторного исследования [6, 7].

Для дифференцированного определения антител одновременно к нескольким антигенам возбудителей TORCH-инфекций авторами настоящей работы разработана медицинская технология иммунохимического лабораторного исследования в формате ЛИБ, при которой в качестве твердой фазы (иммуносорбента) используются полоски нитроцеллюлозной мембраны (стрипы) с дискретно размещенными на них антигенами возбудителей инфекции.

 Специфичность и иммуногенность

При изучении литературных данных о специфичности и иммуногенности для человека были отобраны очищенные нативные и рекомбинантные антигены основных возбудителей TORCH-инфекций для последующего их размещения на иммуносорбенте:

  1. нативный антиген Toxoplasma gondii и рекомбинантный аналог антигена токсоплазмы р30;
  2. нативный антиген вируса краснухи;
  3. рекомбинантный аналог мозаичного антигена цитомегаловируса, содержащий иммунодоминантные последовательности белков рр150, рр52, рр28 и gB;
  4. рекомбинантные аналоги антигена G1 вируса простого герпеса 1 типа и антигена G2 вируса простого герпеса 2 типа.

Кроме этого, на иммуносорбенте были размещены:

  • международный стандарт ВОЗ Anti-Rubella Immunoglobulin, Human NIBSC code: RUBI-1-94, представляющий собой антитела к вирусу краснухи – иммуноглобулины человека класса G в концентрации 15–20 МЕ/мл (линия «Rub. Cut off»);
  • три контрольные линии, две из которых («0,5+» и «2,0+») содержат иммуноглобулины человека класса G или М в разных концентрациях для калибровки результатов исследования, и одна линия («КВО») содержит антитела к IgG/IgM человека для контроля внесения образца. 

Размещение антигенных линий на стрипах представлено на схеме (рисунок).

Определение антител к основным возбудителям TORCH групп

Схема размещения антигенов и контрольных линий на стрипах иммуносорбента

Для оценки чувствительности и специфичности разработанных методик исследованы контрольные сыворотки, содержавшие (n = 94) и не содержавшие (n = 47) антитела к антигенам возбудителей инфекций TORCH-группы:

  • «Стандарт АТ-G(+/-) T. gondii», ЗАО «МБС»;
  • «Рубелла – контрольная панель сывороток», ЗАО «Вектор-Бест»;
  • «Стандарт АТ-G (+/-) ЦМВ» ОСО 42-28-360-01, ЗАО «МБС»;
  • Anti-CMV Mixed Titer Performance Panel PT C203, фирмы Sera Care Life Sciences, USA;
  • «ЦМВ-IgM – контрольная панель сывороток», ЗАО «Вектор-Бест»;
  • «Стандарт АТ-G(+/-) ВПГ-1,2» ОСО 42-28-373-04, ЗАО «МБС»;
  • «ВПГ-IgM, IgG-авидность – контрольная панель сывороток», ЗАО «Вектор-Бест». 

При исследовании всех перечисленных панелей контрольных сывороток с использованием разработанной методики получено полное совпадение результатов определения специфических антител с паспортными характеристиками каждой панели, и таким образом была показана 100% чувствительность и специфичность новой методики.

Клиническую информативность по ГОСТ Р 53022.3-2008 [16] комплекта № 1 новой методики изучали при исследовании 1115 сывороток крови, полученных у беременных женщин и лиц, проходивших лабораторное обследование в диагностическом центре El Clinic (г. Электрогорск) и в Московской областной станции переливания крови (г. Москва).

В качестве реагентов сравнения использовали соответствующие наборы для определения антител к антигенам каждого из возбудителей TORCH-группы методом ИФА, разрешенные к применению в Российской Федерации.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты обнаружения специфических антител класса G к антигенам возбудителей TORCH-инфекций методами ИФА и линейного иммуноблоттинга в 1115 образцах крови

Возбудитель инфекции Токсо- плазма Вирус краснухи ЦМВ ВПГ-1 ВПГ-2
Результат исследования ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ
Положительный 63 65 255 259 219 220 149 152 30 30
Неопределенный 8 5 13 9 5 4 4 0 4 0
Отрицательный 182 183 66 66 99 99 27 28 151 155
Всего 253 253 334 334 323 323 180 180 185 185

Представленные данные демонстрируют наличие расхождений результатов определения антител класса G разными методами (ИФА и ЛИБ): к возбудителю токсоплазмоза – в 3 (1,19%) случаях из 253, краснухи – в 4 (1,16%) из 344, к ЦМВ – в 1 (0,31%) из 323, к ВПГ-1 – в 4 (2,22%) из 180 и к ВПГ-2 – в 4 (2,16%) из 185 случаев. Эти 16 образцов, в которых при выявлении АТ методами ИФА и ЛИБ были получены дискордантные результаты, дополнительно исследованы при использовании наборов реагентов Recomline TORCH Screening IgG фирмы «Микроген» (Германия) (табл. 2).

Таблица 2

Сопоставление результатов обнаружения специфических антител класса G к антигенам возбудителей TORCH-инфекций при использовании линейного иммуноблоттинга в 16 образцах крови

№ образца Возбудитель инфекции
Токсоплазма Вирус краснухи ЦМВ ВПГ-1 ВПГ-2
Л R Л R Л R Л R ВПГ1+2 Л R
1 - - + + - - - + + +
2 - - + + - - - - - -
3 + + + + - - + + - -
4 + + - - - - - - - -
5 + + + + + + + + - +/-
6 - - + + - - - - - -
7 + + +/- +/- +/- + + + + +
8 - - +/- +/- - - - - - -
9 + + + +/- + + + + + +
10 + + + + + + + + + +
11 - - + + + + + + + +
12 - - + + +/- + + + - -
13 + + + + + + + + - -
14 - - + + +/- - + + - -
15 - - + + + + + + + +
16 + + + + + + + + - -
  • R – Recomline TORCH Screening IgG (R).
  • Л – новая методика в формате ЛИБ.

Как следует из приведенных в табл. 2 данных, результаты выявления АТ при использовании новой методики в подавляющем большинстве случаев – в 75 (93,75%) из 80 – совпадали с таковыми при применении набора реагентов Recomline TORCH Screening IgG.

Детализированный анализ полученных данных позволил установить полное совпадение результатов определения специфических антител к возбудителю токсоплазмоза и ВПГ-1 при применении названных методик, расхождение результатов в отношении определения антител к Rubella virus– по 1 образцу, к ЦМВ – по 3 образцам и к ВПГ-2 – по 1 образцу.

При этом из установленных 5 случаев расхождения в 3 – различие заключалось между результатами положительными («+») и неопределенными («+/-»), в 2 случаях – между неопределенными («+/-») и отрицательными («-»).

По совокупности совпадающих результатов исследования биологических образцов методами ИФА и ЛИБ двумя наборами реагентов разных производителей осуществлен расчет и сравнительная оценка показателей клинической информативности (клинической чувствительности, специфичности и диагностической эффективности) предложенной методики определения специфических АТ (табл. 3).

Таблица 3

Показатели клинической информативности определения IgG к возбудителям TORCH-инфекций

Используемые реагенты Возбудитель инфекции
Токсо- плазма Вирус краснухи ЦМВ ВПГ-1 ВПГ-2
Клиническая чувствительность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 99,2 99,1 99,1 98,3 100
Новая методика ЛИБ 100 99,7 99,4 100 100
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 100 100
Клиническая специфичность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 99,6 100 99,7 99,4 98,4
Новая методика ЛИБ 100 100 99,7 100 99,5
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 99,4 100
Диагностическая эффективность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 99,6 99,1 98,8 97,8 98,4
Новая методика ЛИБ 100 99,7 99,1 100 99,5
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 99,4 100

Представленные данные позволили прийти к заключению о достаточно высокой диагностической эффективности разработанной методики и применявшихся наборов реагентов. На основании полученных данных можно полагать, что при выявлении разночтений в результатах скринингового определения специфических IgG методами ИФА и ЛИБ, приоритет имеют данные, полученные методом ЛИБ, так как для них была установлена более высокая диагностическая эффективность (99,4–100%).

Для определения клинической информативности методики, разработанной для определения специфических АТ класса IgM методом ЛИБ, исследовали 860 сывороток крови, полученных от беременных женщин и лиц, проходивших плановое или специализированное обследование в диагностических целях. Наборами реагентов сравнения служили соответствующие наборы реагентов для определения антител IgMк антигенам возбудителей группы TORCH-инфекций, имеющие регистрацию в Российской Федерации. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты обнаружения специфических антител класса М к антигенам возбудителей TORCH-инфекций методами ИФА и линейного иммуноблоттинга в 860 образцах крови

Возбудитель инфекции Токсо- плазма Вирус краснухи ЦМВ ВПГ-1 ВПГ-2
Результат исследования ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ ИФА ЛИБ
Положительный 11 14 9 12 52 62 9 11 4 5
Неопределенный 41 18 11 6 40 16 11 3 12 4
Отрицательный 195 215 216 218 128 142 167 173 190 197
Всего 247 247 236 236 220 220 187 187 206 206

При определении антител класса М получено большее количество расхождений в результате определения АТ при применении методов ИФА и ЛИБ: АТ к возбудителю токсоплазмоза – в 24 (9,72%) случаях из 247, краснухи – в 5 (2,12%) из 236, ЦМВ – в 24 (10,91%) из 220, ВПГ-1 – в 8 (4,28%) из 187 и ВПГ-2 – в 8 (3,88%) из 206 случаев.

Все образцы крови, в которых при выявлении АТ методами ИФА и ЛИБ были получены дискордантные результаты, были дополнительно исследованы при использовании набора реагентов Recomline TORCH Screening IgG фирмы «Микроген» (Германия). Результаты исследования двумя методиками (метод ЛИБ) были сопоставлены, что позволило установить их полное совпадение в 80% случаев: причем при определении специфических АТ IgM к возбудителю токсоплазмоза – в 50% случаев, к вирусу краснухи – в 90%, к ЦМВ – в 75%, к ВПГ-1 – в 83% и к ВПГ-2 – в 100% случаев.

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

Лабораторная диагностика

По совпадающим результатам исследования методом ЛИБ образцы были аттестованы по содержанию в них IgM к основным антигенам возбудителей TORCH-группы и для них рассчитаны показатели клинической информативности по ГОСТ Р 53022.3-2008 (табл. 5).

Таблица 5

Показатели клинической информативности определения IgМ к возбудителям TORCH-инфекций

Используемые реагенты Возбудитель инфекции
Токсо- плазма Вирус краснухи ЦМВ ВПГ-1 ВПГ-2
Клиническая чувствительность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 78,6 75 81,7 81,8 80
Новая методика ЛИБ 100 100 96,55 100 100
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 100 100
Клиническая специфичность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 86,1 98,18 88,9 96,53 96,45
Новая методика ЛИБ 94,8 99,10 98,61 100 100
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 99,42 100
Диагностическая эффективность
Наборы для определения АТ к возбудителям TORCH-инфекций «ЭКОлаб» ИФА 85,8 97,03 87,3 95,7 96,12
Новая методика ЛИБ 95,14 99,15 98,2 100 100
Recomline TORCH Screening IgG ЛИБ 100 100 100 99,5 100

Результаты изучения полученных показателей позволили установить более высокую клиническую информативность определения АТ класса IgМ к антигенам возбудителей TORCH-группы методом ЛИБ (98,6–100%), нежели ИФА (75–98,0%); при этом разработанная авторами методика показала результаты, не уступающие соответствующему зарубежному набору.



Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...


Мероприятия


Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль