text

🎁 Журнал+чайник в ПОДАРОК! УСПЕТЬ ➤➤➤

Здравоохранение

Определение тестостерона в крови

  • 10 января 2017
  • 705

Определение тестостерона в крови играет значимую роль в клинической оценке многих эндокринных заболеваний.

  • При обследовании мужчин исследование уровня тестостерона способствует выявлению гипогонадизма различной этиологии, преждевременного полового развития или отставания физического развития у мальчиков, обеспечивает мониторинг адекватности гормональной заместительной терапии андрогенами.
  • Чрезвычайно важен мониторинг содержания тестостерона в крови у пациентов с раком простаты, получающих гормональную терапию.
  • Одновременное определение тестостерона, лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона способствует получению информации о природе гормональной дисфункции семенников. В частности, определение концентрации тестостерона как объективного маркера необходимо для подтверждения возрастного дефицита гормона при назначении гормональной терапии.
  • У женщин определение уровня тестостерона в крови необходимо для оценки функции гонад при гирсутизме, алопеции, акне, подозрении на андрогенсекретирующие опухоли яичников и надпочечников, при мониторинге лечения гирсутизма для выбора оптимальной дозы препарата, подавляющего избыточную продукцию андрогенов [1].

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения тестостерона в крови

В лабораторной практике в настоящее время для определения концентрации тестостерона, как и других гормонов, широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Метод ИФА появился в лабораторной практике в середине 1960-х гг. в результате бурного прогресса биотехнологии, иммунологии и др. наук. В 1980-е гг. XX века технология ИФА заняла ведущее место в лабораторной диагностике специфических заболеваний.

Развитие научно-технического прогресса способствовало совершенствованию методов иммуноанализа, около 25 лет назад появились методы иммуноанализа 3-го поколения (иммунохемилюминесцентный анализ) с использованием европия в качестве метки антител.

Технология иммуноанализа с использованием европия была предложена группой финских ученых (система «Дельфия») и быстро завоевала большую популярность.

В это же время английскими учеными разрабатывался метод усиленной хемилюминесценции (ИХА), основанный на применении ферментов для усиления сигнала реакции и субстратов люминофоров, с регистрацией сигнала при использовании автоматических анализаторов закрытого типа.



Методы иммуноанализа 3-го поколения характеризуются более высокой чувствительностью и позволяют определять низкие концентрации тестостерона (1 × 1013М) равно как и других гормонов [1, 2].

В настоящее время методы ИХА, вошедшие в практику лабораторной диагностики в  результате автоматизации лабораторных исследований, доминируют в  эндокринологических и клинических биохимических лабораториях всего мира, заменив методы радиоиммунного анализа (РИА), использовавшиеся в качестве эталонных методов в середине прошлого века.

Многочисленные исследования по сопоставимости результатов, полученных методами ИХА и РИА, показывают, что данные ИХА сопоставимы с РИА, а по отдельным характеристикам метод ИХА превосходит РИА [2].

Автоматизированные системы закрытого типа минимизируют влияние человеческого фактора на результат исследования.

Основные преимущества автоматизированных систем:

  • высокая производительность,
  • безопасность персонала,
  • стандартизация аналитического этапа исследований,
  • оперативность в выдаче результатов пациенту и экономическая выгода [3].

В последнее время в практику лабораторных исследований стали внедряться методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, основанные на разделении биологического материала на фракции и выделении нужных аналитов [15].

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ,UPLC или LC) является одним из самых точных методов аналитической химии. ВЭЖХ позволяет качественно и количественно определить практически все встречающиеся в живом организме соединения: от низкомолекулярных (витамины, сахара, аминокислоты, нуклеотиды, пептиды и т. д.) до высокомолекулярных биологически активных полимеров (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, и др.). ВЭЖХ применяется:

  1. для проведения терапевтического лекарственного мониторинга и фармакокинетических исследований с целью определения индивидуальной схемы дозировки препаратов и контроля качества лечебных и реабилитационных процедур;
  2. для диагностики ряда заболеваний (определение различных метаболитов в биологических образцах);
  3. для контроля качества биологически активных добавок к продуктам питания;для контроля качества лекарственных средств.

Однако активное применение ВЭЖХ в повседневной рутиной практике лабораторной службы ограничено следующими причинами:

  1. дорогостоящая аппаратура и расходные материалы (колонки, элюенты);
  2. отсутствие стандартизированного протокола исследований и необходимость привлечения квалифицированных специалистов химического анализа.

Масс-спектрометрия при определении тестостерона в крови

Одним из методов современного анализа биологического образца является масс-спектрометрия.

Масс-спектрометрия (MS) – физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду.

Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать белки, оценить, какие изменения произошли с их структурой вследствие различных взаимодействий, определить пути метаболизма различных лекарственных средств и других соединений и идентифицировать метаболиты (например, исследование мочи диабетического больного, рис. 2).

Масс-спектрометрия – единственный метод, решающий все эти и многие другие задачи аналитической биохимии [5]. В научных журналах уже появилось незначительное количество публикаций в области исследования стероидных гормонов методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (UPLC/MS или LC/MS) [9, 11, 12, 17].

В отдельных публикациях авторы предлагают использовать метод LC/MS как «золотой стандарт» диагностики в медицинских лабораториях при рутинном определении тестостерона у пациентов, считая, что метод обладает большей чувствительностью при низких концентрациях, на его результаты не влияет возможная интерференция других стероидов и лекарственных средств [6, 13].

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 1. Хроматограмма стандартных растворов стероидных гормонов

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 2. Хроматограмма мочи диабетического больного

Основными этапами метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) являются:

Предварительная подготовка биоматериала: экстракция из биоматериала и выделение требуемого аналита. Процедура требует затрат на реагенты; соответствующего лабораторного оборудования, соблюдения четкого регламента всех стадий и достаточно высокой квалификации химика-аналитика. Процедура трудоемкая, достаточно длительная по времени.

Жидкостная хроматография. Использование жидкостной хроматографии подразумевает несколько этапов работы: подготовка хроматографического оборудования к работе и обязательная калибровка оборудования стандартными растворами гормонов (рис. 1); оценка и анализ хроматограмм с интерпретацией пиков распределения стандартов (рис. 2) – работа, требующая высокой квалификации химика-аналитика [5].

Масс-спектрометрия. Для получения спектров можно использовать как один, так и два последовательно соединенных масс-спектрометра. Анализ и интерпретация масс-спектрограмм белков осуществляются с использованием каталога или библиотеки.

На сегодняшний день масс-спектрометрия, в частности технология MALDI-TOF нашла широкое применение в области клинической микробиологии при идентификации микроорганизмов.

Метод хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией нашел свое место и в качестве новой медицинской технологии в оценке микроэкологического статуса человека [5]. Метод проходил апробацию в медицинских учреждениях г. Москвы в течение пятнадцати лет, и только в 2010 г. Росздравнадзором было дано разрешение на его применение в лабораторной диагностике.

Для работы на масс-спектрометре требуется квалифицированный специалист с опытом работы. К тому же, профили масс-спектрограмм тестостерона [7, 16] демонстрируют неоднозначность вопроса определения уровня тестостерона методом LC/MS (рис. 3).

В зависимости от концентрации тестостерона в биологическом материале будет отмечаться на спектрограмме четкость или размытость профиля, количество, характер пиков и их расположение будет неодинаковым, что создает определенные трудности при интерпретации результатов исследования при масс-спектрометрии.

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 3. Спектр тестостерона с концентрацией в сыворотке крови 0,006 нмоль/л (1,7 нг/дл)

В отдельных публикациях, авторы отмечают что «Наиболее выраженная систематическая ошибка наблюдается при определении низких концентраций тестостерона, то есть у тех пациентов, у которых при клиническом обследовании заподозрено наличие дефицита андрогенов» при сопоставлении результатов определения тестостерона разными методами [6, 7, 13]


В 2009 г. за рубежом было проведено исследование по сравнению методик технологии LC/MS, используемых в отдельных лабораториях (табл. 1), результаты которого показывают различие в функциональной чувствительности и высокий коэффициент вариации при низких концентрациях тестостерона [7, 16].

Таблица 1. Сравнение методик высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией

Параметры Y. Chen et al [15] Kushnir et al [8] Turpeinen et al [12]
Вид масс-спектрометрии LC/MS* LC/MS LC/MS
Стадия экстракции + + +
Объем образца, (mL) 0,25 0,1 0,25–0,5
Время выполнения исследования одного образца (min)* 6,5 3 10
Функциональная чувствительность, (nM) 0,056 0,035 0,15
Коэффициент вариации (CV) в пределах одного тестирования, % 4,5 при 1,3нМ 2,4 при 11нМ 1,9 при 3,4нМ 6,2 при 4,2нМ 2,3 при 7,2нМ 3,1 при 2нМ 0,9 при 20нМ

* LC/MS - жидкостная хроматография с масс-спектрометрией.

Ниже представлены данные (табл. 2) сравнения рабочих диапазонов определения тестостерона при использовании хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией [8].

Таблица 2  Рабочие диапазоны определения тестостерона в крови методом хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией

Лаборатории Принцип измерения Рабочий диапазон, (нг/дл)
Endocrine and metabolic research laboratory at Los Angeles biomedical research institute LC/ MS* 2,0–2000
LabCorp LC/ MS* 2,5–5000
Brigham research assay core (BRAC) laboratory at harvard medical school LC/ MS* 1,0–2000
Covance central laboratories servicel, Inc. LC/ MS* 2,0–8000
ARUP laboratories, Inc. LC/ MS* 1,0–2500
Clinical chemistry sahlgrenska university hospital Gothernbrug, Sweden GC/ MS** 2,5–1000
ZRT laboratory LC/ MS* 10–1000
Pathology associates medical laboratories, LLC LC/ MS* 3,5–1000

LC/ MS* – жидкостная хроматография с масс-спектрометрией.GC/ MS** – газовая хроматография с масс-спектрометрией.

Сравнение результатов применения методов LC/MS и существующих иммунологических методов для определения тестостерона, проведенное на образцах крови 30 женщин и 32 мужчин [7] выявило их корреляцию (рис. 4).

Сравнительная оценка  методов определения тестостерона

Рис. 4. Корреляция результатов определения концентрации тестостерона, полученных иммунологическим методом и LC/MS

Основные проблемы применения метода LC/MS для определения тестостерона в крови пациентов, заключаются в следующем:

  1. Метод LC/MS не валидирован: существует множество вариантов подготовки образцов для выделения тестостерона из сыворотки крови; условий проведения LC и снятия масс-спектров. Отсутствуют стандарты и единые референсные диапазоны.
  2. Все этапы подготовки образцов – ручные процедуры, что не исключает возникновение ошибок на любой стадии выделения тестостерона из биологического материала. Наличие дополнительных ручных процедур увеличивает время исследования образца и выдачи результата пациенту: пропускная способность исследований для определения концентрации тестостерона методом LC/MS составляет 11 образцов/ч [4].
  3. Жидкостной хроматограф и масс-спектрометр, так же как и любые другие анализаторы, требуют выполнения калибровок. Калибровка хроматографа при получении спектра тестостерона осуществляется по нескольким стандартам, что приводит к удорожанию исследования.
  4. Для проведения исследований по определению концентрации тестостерона методом LC/MS КДЛ должны будут ввести в штат лаборатории дополнительного сотрудника с высшим профильным образованием в области аналитической химии и молекулярной биологии.
  5. По информации на начало 2007 г., только 0,5% медицинских лабораторий за рубежом начали применять метод LC/MS для рутинных исследований концентрации стероидных гормонов, в том числе и тестостерона [8].
Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.