text
Портал для медицинских работников

Быстрый способ выявления устойчивых к рифампицину изолятов Mycobacterium tuberculosis

  • 15 ноября 2010
  • 25

Одним из наиболее гибких и многофункциональных инструментов современной молекулярной биологии является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время она стала неотъемлемой компонентой практически всех методических подходов, предназначенных для выявления структурного полиморфизма ДНК.

Как правило, большинство протоколов для поиска неизвестных мутаций (или предварительно локализованных) требуют извлечения продуктов ПЦР из реакционной смеси и выполнения дополнительных процедур обработки. К таким методам относятся анализ полиморфизма структур одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP), температурный градиентный капиллярный электрофорез (TGCE) и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК (RFLP). Кроме дополнительных манипуляций с продуктами ПЦР вне реакционной пробирки, эти методы часто требуют использования дополнительного оборудования.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Появление метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (real-time ПЦР) дало начало новому семейству методов исследования полиморфизма ДНК, среди которых наиболее распространенными являются аллель-специфичный ПЦР и использование меченных флуорофорами зондов (например, Taq-man).

В 1997 г. Витнером был предложен новый вид анализа продуктов ПЦР, основанный на использовании интеркалирующих флуоресцентных красителей ДНК и возможностей оборудования для проведения real-time ПЦР, – анализ кривых плавления амплифицированных фрагментов ДНК (melt curve analysis). Сущность метода заключается в том, что после проведения стандартной ПЦР реакционная смесь, содержащая амплифицированный фрагмент ДНК, подвергается нагреванию, что приводит к переходу фрагмента ДНК из двухцепочечной формы в одноцепочечную, диссоциации красителя и падению уровня флуоресценции. В результате получается кривая плавления, специфичная для конкретного ПЦР-фрагмента. Мониторинг плавления ДНК с использованием интеркалирующих красителей является чувствительной процедурой, для которой присутствующее количество ДНК (нг) является достаточным. Эти количества ДНК являются типичными для стандартной ПЦР-реакции.

Попытки увеличить информативность флуоресцентного мониторинга плавления ДНК привели к появлению метода анализа кривых плавления с высоким разрешением (high resolution melting curve analysis – HRM, HRMA, HRMCA). Мутации в пределах анализируемого ПЦР-фрагмента ДНК приводят к небольшим изменениям температуры плавления, что сдвигает кривую по оси значения температуры или в отдельных случаях меняет ее форму. В частности, например, замены G→A в коротких амплифицированных фрагментах ДНК могут менять температуру плавления в пределах 0,8–1,4 °C. Замены нуклеотидов типа A→T или G→C меняют температуру плавления ампликона за счет изменения их взаимодействия с соседними нуклеотидами, данное различие обычно не превышает 0,4 °C. Несмотря на малые различия в температуре, эти структурные изменения ДНК могут быть детектированы при выполнении ряда условий, а именно: использование оборудования, обеспечивающего высокую однородность температуры между анализируемыми образцами и возможность снятия флуоресценции с шагом 0,05–0,2 oC; тщательная оптимизация условий ПЦР; использование подходящих интеркалирующих красителей; анализ кривых плавления с помощью специализированного математического обеспечения, делающего анализ различий более объективным.

Для разработки быстрого и недорогого метода детекции наиболее распространенной мутации в 531-м кодоне гена rpoB Mycobacterium tuberculosis, вызывающей устойчивость к антитуберкулезному препарату рифампицину, мы применили HRM-анализ. Использовали интеркалирующий краситель SYBR Green I, 20 000-кратный раствор в DMSO (MolProbe, USA), 2 мМ dNTP (ИХБФМ СО РАН), термостабильную ДНК-полимеразу Taq-cold (20 ед./мкл) (ИХБФМ СО РАН).

Был проведен анализ ДНК 61-го изолята микобактерий туберкулезного комплекса, выделенных от больных с легочными формами туберкулеза на территории Северо-Западного и Западно-Сибирского регионов РФ за период с 2000 по 2008 г. Штаммы микобактерий туберкулеза выращивали на среде Левенштейна – Йенсена в течение 4 недель. Выделение ДНК из культуры M. tuberculosisпроводилось согласно ранее описанной методике.

Устойчивость к антибиотикам определялась согласно приказу Минздрава СССР от 08.06.1978 № 558 “Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе” методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна – Йенсена, где рекомендованы следующие концентрации: стрептомицин 10 мкг/мл, изониазид 1 мкг/мл, рифампицин 40 мкг/мл, этамбутол 5 мкг/мл, канамицин 30 мкг/мл. ПЦР проводили в объеме 20 мкл, содержащем: 67 мМ трис-HCl (рН 8,9); 16мМ сульфата аммония; 1,5 мМ магния хлорида; 0,01% Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкM растворы олигонуклеотидных праймеров (Rpo11 5’-GACGTGGAGGCGATCACAC и Rpo12 5’-GGCACGCTCACTTGACAGAC) и 1 EД/акт Taq-полимеразы. Реакцию проводили с использованием амплификатора CFX96 (Bio-Rad, USA) в следующем режиме: с начальной денатурацией при 96 °С – 2 мин, далее в течение 35 циклов с денатурацией при 95 °С – 5 с, отжигом праймеров при температуре 63 °C – в течение 5 с и синтезом при 72 °С – 5 с. Для оценки качества ПЦР аликвоты реакции фракционировали в 6%-м полиакриламидном геле. Для анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализа) использовали Precision Melt AnalysisTM Software (Bio-Rad, USA).

Прямое секвенирование фрагментов ПЦР области гена rpoB, кодирующей аминокислоты с 507-й по 533-ю (кластер I), было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора Big dye 3.1 (Центр коллективного пользования СО РАН).

Статистическую обработку проводили с помощью программного пакета Statistica 6.0 (Statsoft Inc.).

Cкрининг ДНК изолятов M. tuberculosis на наличие мутации Ser531Leu гена rpoB методом прямого секвенирования позволил нам отобрать 17 изолятов, несущих эту мутацию. Нами также было отобрано 10 рифампицин-чувствительных изолятов, не несущих мутаций в коровой области гена rpoB. Кроме того, в нашей коллекции были 12 образцов ДНК из мокроты, идентифицированные как “положительные” бактериальным посевом с последующим выделением ДНК из полученных бактериальных культур. Из них 2 изолята несли мутацию Ser531Leu и 7 изолятов не содержали мутаций коровой области гена rpoB. Полученную коллекцию ДНК с описанными фенотипическими и генотипическими характеристиками использовали для разработки метода скрининга наиболее распространенной мутации в 531-м кодоне гена rpoB M. tuberculosis с помощью HRM-анализа.

На первом этапе для оптимизации ПЦР с SYBR Green I использовали его 1-, 0,75- и 0,5-кратные концентрации. Было показано, что уменьшение концентрации SYBR Green I ведет к соответствующему уменьшению амплитуды кривой, в то же время Ct реакции остается постоянным, что говорит о равной эффективности ПЦР. Для оценки способности HRM-анализа детектировать мутацию Ser531Leu проводили амплификацию четырех ДНК изолятов M. tuberculosis, несущих мутацию (“М+”), и четырех контрольных (“К”). Способность детектировать мутацию оценивали как разность Tm ± SD, где Tm соответствовала вершине пика кривой (-dF/dT). Полученные данные (таблица) свидетельствуют о том, что оптимальной является минимальная концентрация SYBR Green I.

Оценка разницы Tm амплифицированных фрагментов 
ДНК гена rpoB четырех изолятов M. tuberculosis, 
несущих мутацию (“М+”), и четырех контрольных (“К”) в зависимости 
от концентрации SYBR Green I

СSYBR Green I

ΔTm

SD*

0,29

0,131

0,75×

0,43

0,07

0,5×

0,45

0,02

* SD – стандартное отклонение.

При ее использовании мы смогли правильно классифицировать все 17 “М+” и 12 “К” изолятов как с помощью визуального анализа кривых плавления экспериментальных образцов с соответствующими контрольными, так и с помощью специализированного программного обеспечения. Далее мы попытались применить оптимизованный метод для анализа ДНК из мокроты пациентов с известным статусом мутаций гена rpoB. Нам удалось правильно классифицировать 2 образца с мутацией Ser531Leu и 6 образцов без мутации. В одном случае были получены отрицательные результаты: реакция ПЦР не выявила ДНК микобактерии. Таким образом, предложенный нами подход обладает высокой специфичностью и чувствительностью при анализе ДНК, выделенных из мокроты. Тем не менее для значимого определения указанных выше параметров необходимо тестирование метода на выборке значительно большего объема.

Сегодня общепринятым является мнение, что краситель SYBR Green I, несмотря на его распространенность и низкую себестоимость, плохо подходит для проведения HRM-анализа ввиду того, что в умеренно высоких концентрациях начинает ингибировать ПЦР. Невозможность использования избытка красителя для более полного и равномерного связывания с продуктом ПЦР ухудшает разницу кривых плавления, мало различающихся по структуре фрагментов ДНК (например, содержащих нуклеотидные замены). К новым, так называемым насыщающим красителям относятся LC Green I, EVA Green, SYTO 9, 13 и 82, Chromphy и некоторые другие. Указанные красители, кроме того, значительно менее чувствительны к контексту ДНК и GC-содержанию. В проведенном исследовании мы показали, что уменьшение концентрации SYBR Green I улучшает дискриминацию нуклеотидной замены С→T в 531-м кодоне гена rpoB. Индекс дискриминации не улучшается при использовании “насыщающего”, широко применяемого для HRM-анализа красителя SYTO 9. Возможно, этот эффект связан с высоким (около 75%) GC-содержанием ПЦР-фрагмента, что делает связывание SYBR Green I более эффективным и улучшает разрешение кривых плавления.

Разработанный нами метод для детекции мутации Ser531Leu гена rpoB M. tuberculosis обладает наиболее низкой стоимостью среди описанных к настоящему времени альтернативных подходов. Суммарное время проведения анализа начиная с получения биологического образца (бактериальные клетки или мокрота) не превышает 3,5 ч.

Устойчивость к рифампицину, в противоположность таковой к изониазиду, у 80–90% штаммов M. tuberculosis обусловлена точковыми мутациями в небольшой области (81 п. о.) гена rpoB, кодирующей аминокислоты с 507-й по 533-ю (клас­тер I). Более 90% изолятов, устойчивых к рифампицину, также устойчивы и к изониазиду; в большинстве географических регионов распространенность мутации 531-го кодона гена rpoB превышает 50%. Таким образом, скрининг устойчивости к рифампицину с использованием предложенного нами подхода, учитывая быстроту выполнения и низкую себестоимость исследования, может быть эффективен для диагноза антибиотико-устойчивого туберкулеза.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.