text
Портал для медицинских работников

Cтандартизация протоколов цитогенетического исследования при острых лейкозах, миелопролиферативных заболеваниях и миелодиспластических синдромах

  • 15 декабря 2010
  • 26

Цитогенетическое исследование – стандартное кариотипирование, дополненное методом флуоресцентной гибридизации in situ, в настоящее время является обязательным при постановке гематологического диагноза. Определение специфических перестроек позволяет правильно выбрать протокол лечения, отслеживать результаты терапии, вовремя начать поиск донора для трансплантации костного мозга.

Учитывая важность результатов цитогенетического исследования в повседневной практике врача-гематолога, возросшее число цитогенетических лабораторий, участвующих в обследовании больных гемобластозами, возникает необходимость в разработке единых протоколов цитогенетического исследования при отдельных нозологических формах с указанием необходимого и достаточного объема исследования. Очевидно, что такие протоколы будут подвергаться постоянным уточнениям по мере накопления новых данных и разработки новых программ терапии.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

В европейских странах протоколы цитогенетического исследования определяются центрами контроля качества генетических исследований и исследовательскими группами в рамках различных протоколов лечения. Европейским сообществом цитогенетиков, работающих с гематологическими клиниками (European Leukemia Net, www.leukemia-net.org), было предложено разработать единые протоколы цитогенетического исследования при гематологических заболеваниях. В нашей стране объем необходимого и достаточного исследования определяется исследовательскими протоколами, разработанными ведущими учреждениями в области гематологии.

В связи с возросшей ролью методов стандартной и молекулярной цитогенетики в диагностике опухолей кроветворной системы представляется важным обсудить основные положения стандартов цитогенетического исследования при различных онкогематологических заболеваниях, предложенных Европейской группой по изучению лейкемии. В основу данных стандартов положены практические рекомендации Ассоциации клинических цитогенетиков Великобритании (Association for Clinical Cytogenetics).

Так как различные гематологические заболевания требуют разных условий культивирования и характеризуются различными генетическими перестройками, для выявления которых требуются различные ДНК-зонды, были предложены отдельные протоколы для различных нозологических форм. В данной статье мы рассмотрим предложения по цитогенетическому и молекулярно-генетическому исследованию при остром лимфобластном лейкозе, остром миелобластном лейкозе, хроническом миелолейкозе, хронических миелопролиферативных заболеваниях и миелодиспластических синдромах. Также даны краткие рекомендации по сбору образцов, культивированию и анализу результатов.

Получение материала, культивирование, анализ и оценка результатов

Оптимальное число клеток для культивирования составляет 1–3 млн в 1 мл среды. Для получения наилучших результатов рекомендовано брать 2–5 мл костного мозга или 5–10 мл крови в пробирку с гепарином. На практике у взрослых больных объем получаемого костного мозга составляет 1,5–3 мл, у детей объем получаемого костного мозга и крови значительно меньше. Для быстрой диагностики методом FISH следует сделать 3 мазка костного мозга. Костный мозг/кровь должны быть доставлены в лабораторию в течение 24 ч.

Для всех гематологических опухолей, за исключением хронического лимфолейкоза, исследование костного мозга предпочтительнее, чем периферической крови. При апластической анемии и миелодиспластическом синдроме без бластных клеток в периферической крови исследуется только костный мозг. Время экспозиции с колхицином/колцемидом и его концентрацию лаборатории, как правило, подбирают самостоятельно. Рекомендовано краткосрочное культивирование (24–48 ч) с добавлением колцемида на 0,5–2 ч, однако, по нашему мнению, лучшие результаты достигаются при культивировании с добавлением малых доз колхицина (колцемида) на ночь и использовании “прямых” проб. Также “прямые” пробы в дополнение к 24-часовым следует ставить при острых лейкозах, лимфомах, миелодиспластических синдромах у детей.

Для получения достоверных результатов необходимо кариотипировать по крайней мере 10–20 аномальных метафаз или 20–25 нормальных метафаз.

В анализе каждого образца должны принимать участие два сотрудника лаборатории, один из которых является опытным сотрудником, имеющим сертификат специалиста.

При исследовании методом FISH анализируется 100–200 ядер. При обнаружении однозначно позитивных клеток может быть проанализировано и меньшее число клеток. При необходимости количество анализируемых клеток может быть увеличено. Для быстрой FISH-диагностики лимфом и солидных опухолей исследуют отпечатки опухоли или мазки костного мозга (при его инфильтрации). Это позволяет выбрать для анализа клетки определенной морфологии.

FISH-анализ также проводится по меньшей мере двумя исследователями, один из которых должен быть опытным сотрудником, имеющим сертификат специалиста.

Алгоритм цитогенетического исследования 
при различных заболеваниях

Острый лимфобластный лейкоз

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Для детей постановка прямой культуры, на наш взгляд, весьма желательна. Для флуоресцентной in situ гибридизации предпочтительно использовать клетки из прямой культуры или мазки костного мозга.

Минимальным необходимым объемом исследования, проводимым при В-клеточном остром лимфобластном лейкозе у больных любого возраста, является стандартное кариотипирование и тестирование на наличие химерного гена BCR/ABL методом FISH или “real-time” ПЦР.

У детей при нормальном кариотипе или недостаточном качестве/количестве метафаз, или аномальном кариотипе с комплексными и неспецифическими перестройками желательно исследование методом FISH не только с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL, но и с ДНК-зондом к химерному гену ETV6/RANX(AML1) – для выявления острых лимфобластных лейкозов с транслокацией t(12;21), имеющих хороший прогноз, однако пока не выделяемых в отдельный лечебный протокол. Кроме того, ДНК-зонд ETV6/RANX(AML1) позволяет обнаружить довольно редко встречающуюся аномалию – амплификацию гена AML1 – недавно обнаруженный маркер неблагоприятного прогноза, а также предположить наличие гиперплоидного кариотипа.

Выявление перестроек гена MLL методом FISH является дополнительным к кариотипированию и молекулярно-биологическому исследованию, т. к. определяющее значение для прогноза и выбора тактики лечения имеет определение гена-партнера, участвующего в перестройке.

При нормальном кариотипе или отсутствии митозов С. Haferlach и соавторы рекомендует у детей также применять набор из 4–7 центромерных проб (обычно 7, 4, 10, 17 и 5, 18, 14, 13 или Х на выбор) для выявления гипо- и гиперплоидии. Так же поступают и при обследовании детей, страдающих острым миелобластным лейкозом, в рамках протокола лечения острых лимфобластных лейкозов Berlin-Frankfurt-Münster (BFM) Study Group. Однако такое исследование является крайне дорогим и трудоемким и может быть проведено только в рамках специальной программы.

При Т-клеточных острых лимфобластных лейкозах значительная часть перестроек имеет субмикроскопический характер. European Leukemia Net рекомендовано применение проб для CDKN2A, SIL/TAL, NUP214/ABL1. Однако это также возможно лишь в специализированных лабораториях в рамках утверж­денных протоколов.

Наблюдение за остаточной болезнью при остром лимфобластном лейкозе методом G-полос не проводится. В отдельных случаях показано исследование методом FISH. При Ph-позитивном остром лимфобластном лейкозе мониторинг минимальной остаточной болезни целесообразно проводить методом “real-time” ПЦР.

При рецидиве заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормальном кариотипе анализируется 30 метафаз. При поздних рецидивах следует учитывать высокую вероятность появления второй опухоли и при отсутствии диагностической перестройки, на наш взгляд, целесообразно исключить перестройки гена MLL и моносомию 7 (в зависимости от предшествующей терапии) как наиболее частые характеристики вторичных лейкозов.

Острый миелобластный лейкоз

Цитогенетическое исследование методом G-полос остается “золотым стандартом” в диагностике острого миелобластного лейкоза, т. к. хромосомные перестройки выявляются в 85–95% случаев.

Исследуется костный мозг, в отдельных случаях допустимо исследование периферической крови (при циркуляции бластных клеток). При аберрантном кариотипе анализируется 10–20 метафаз, при нормальном кариотипе – 20–25 метафаз.

Время культивирования составляет 24–48 ч. У детей желательна постановка и прямой культуры. При промиелоцитарном лейкозе постановка 48-часовой культуры обязательна.

При подозрении на острый промиелоцитарный лейкоз и нормальном кариотипе или отсутствии митозов показано исследование с ДНК-зондом для выявления химерного гена PML/RARa. Во всех случаях предполагаемого, по данным морфологического и цитохимического исследований, промиелоцитарного лейкоза следует направить материал для исследования методом FISH или “real-time” ПЦР в одну из специализированных лабораторий. При аномальной эозинофилии проводят исследование с ДНК-зондом для выявления inv(16)(p13;q22) или t(16;16)(p13;q22). При бифенотипическом варианте – исследование с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL. При отсутствии морфологических особенностей и нормальном кариотипе или отсутствии митозов для своевременного выявления группы высокого риска следует провести исследование методом FISH с ДНК-зондами для выявления t(8;21)(q22;q22), перестроек гена MLL, моносомии 7, inv/t(3p21;3q26).

Исследование после индукционной терапии может быть полезным при рефрактерном течении заболевания и при невозможности провести молекулярно-биологическое исследование (например, при моносомиях и трисомиях). Целесообразно в этих случаях исследование методом FISH. В целом наблюдение за минимальной остаточной болезнью цитогенетическими методами не проводится.

В случае рецидива заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормальном кариотипе анализируется 30 метафаз, при наличии возможности следует провести исследование методом FISH. При поздних рецидивах также следует учитывать высокую вероятность появления второй опухоли.

Миелодиспластические синдромы

При работе с миелодиспластическими синдромами помогает тесное сотрудничество с лечащим врачом и морфологами, что позволяет правильно выбрать ДНК-зонды для дополнительного исследования.

Материал для исследования – всегда костный мозг. Культивирование в течение 24 ч предпочтительнее (с колцемидом/колхицином на ночь или на 0,5–2 ч до фиксации). При обнаружении аномалии анализируется 10–20 метафаз, при нормальном кариотипе – 20–25. При обнаружении одной клетки с потерей хромосомы 7 количество анализируемых метафаз следует увеличить до 30.

При нормальном кариотипе или отсутствии митозов у взрослых желательно провести исследование методом FISH для выявления делеции хромосомы 5 (del(5q)), моносомии 7/del(7), трисомии 8. У детей – для выявления моносомии 7/del(7) и трисомии 8.

В случае апластической анемии исследование проводится по алгоритму исследования при миелодиспластическом синдроме.

Хронический миелолейкоз

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Как свидетельствует наш опыт, прямая проба и 24-часовое культивирование дают достаточное количество митозов. В момент первоначальной диагностики возможно исследование как клеток костного мозга, так и периферической крови, однако костный мозг в данном случае предпочтительнее. Для наблюдения за цитогенетическим ответом во время гематологической ремиссии исследуется костный мозг.

FISH-анализ на интерфазных ядрах для выявления химерного гена BCR/ABL выполняют во всех случаях, т. к. для мониторинга ответа на лечение методом FISH необходимо знать картину распределения сигналов в дебюте заболевания. Случаи с образованием только одного слитного сигнала не подходят для мониторирования методом FISH. Желательно выполнять исследование всем больным с пробой не только к гену BCR/ABL, но и выявляющей делецию 9q34, одного из маркеров резистентности к терапии.

Для определения цитогенетического ответа на лечение основным методом остается стандартное цитогенетическое исследование 25–30 метафаз. При отсутствии митозов анализируется 100–200 ядер методом FISH. В фазе акселерации и бластного криза анализируют 20–25 метафаз, сконцентрировав внимание на поиске дополнительных перестроек.

Для диагностики других миелопролиферативных заболеваний применяют стандартное кариотипирование. Методом FISH или “real-time” ПЦР исключают образование химерного гена BCR/ABL и перестройки гена PDGFRB. Обязательно молекулярно-биологическое исследование для выявления мутаций гена JAK2.

При гиперэозинофильном синдроме помимо кариотипирования выполняют FISH-анализ для выявления перестроек генов PDGFRA и FIP1L1.

Стандартное цитогенетическое исследование по возможности должно проводиться всем больным гематологическими заболеваниями. На какой из молекулярных методов детекции основных диагностических транслокаций – FISH или “real-time” ПЦР – опираться при диагностике, зависит от возможностей и задач клиники. Стремительно развивающиеся молекулярно-биологические методы (“real-time” ПЦР, microarrays), позволяющие быстро выявить специфические транслокации и pяд прогностически важных генетических изменений, которые невозможно обнаружить цитогенетическими методами (мутации генов NPM1 и FLT3 при остром миелобластном лейкозе, JAK2 при хронических миелопролиферативных заболеваниях, IgVH статус при хроническом лимфолейкозе), несомненно, несут важную диагностическую информацию, однако по-прежнему не могут заменить стандартное кариотипирование.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.