text

🎁 Журнал+чайник в ПОДАРОК! УСПЕТЬ ➤➤➤

Здравоохранение

Перспективы применения методов молекулярной паразитологии в мониторинге социально значимых паразитозов

  • 15 апреля 2011
  • 168

В 1990-х гг. как в нашей стране, так и за рубежом появились “новые” и “возвращающиеся” социально опасные паразитозы, заражение которыми происходит из-за контаминации их возбудителями среды обитания человека. Возбудители некоторых паразитозов рассматриваются как потенциальные факторы биологической угрозы, ряд паразитарных заболеваний являются ВИЧ-ассоциированными и приводят к смертельным исходам. Наиболее частым патологическим проявлением паразитозов является иммуносупрессия. В результате паразитозы способствуют более частому возникновению других болезней и патологических состояний, а также осложняют их течение.

Вследствие интенсивной миграции населения нарастающими темпами идет процесс завоза паразитарных болезней из эндемичных стран. Ситуация еще более ухудшается из-за роста оппортунистических протозойных инфекций (токсоплазмоза, криптоспоридиоза, пневмоцистоза, лейшманиозов и др.), обусловленного ослабленным иммунным статусом населения вследствие аллергических состояний, эпидемии ВИЧ-инфекции, неблагоприятных экологических условий.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

В связи с этим существует необходимость в современных высокочувствительных методах мониторинга паразитарных заболеваний (лабораторной диагностике паразитозов, мониторинге лекарственной устойчивости возбудителей, контроле эффективности лечения, поиске внутривидовых различий паразитов и др.).

В настоящее время диагностика паразитарных болезней часто основывается на выявлении простейших микроскопическими методами. Иногда прибегают к культивированию на специальных средах или путем пассажей на лабораторных животных (биологическая проба). В последние годы расширился спектр иммунологических методов диагностики паразитозов. В зависимости от локализации возбудителя материалом для исследования могут служить кровь, мокрота, испражнения, образцы тканей (биоптаты), спинномозговая жидкость и др. При некоторых паразитарных болезнях используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации ДНК паразита в биологических материалах.

ПЦР в настоящее время является одним из наиболее важных диагностических инструментов исследования геномов возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний. В сравнении с традиционными методами диагностики ПЦР обладает более высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизма непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя, что снижает трудозатраты. Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных паразитов (малярия, лейшманиозы, токсоплазмоз и др.).

Различные варианты оборудования для ПЦР позволяют проводить исследования как в условиях полной автоматизации процесса, так и при чередовании ручных и автоматизированных этапов, что делает метод ПЦР доступным не только научным учреждениям и крупным медицинским центрам, но и клиническим лабораториям и паразитологическим лабораториям системы Роспотребнадзора.

Широкое внедрение метода ПЦР в клиническую лабораторную диагностику требует повышения уровня информированности медицинских работников о теоретических основах и возможностях современных методических подходов и интерпретации полученных результатов.

Внедрению ПЦР-диагностики паразитозов в практику может способствовать существование ПЦР-лабораторий в крупных медицинских центрах, осуществляющих ПЦР-диагностику возбудителей ряда инфекционных болезней: вирусов гепатита, иммунодефицита человека, микоплазм и др. Диагностика паразитозов не потребует специальной подготовки персонала, а имеющиеся стандартные наборы реактивов должны быть дополнены лишь специально синтезированными праймерами.

В настоящее время метод ПЦР применяют при следующих паразитозах:

  • малярия (только научные исследования);
  • лейшманиозы (рутинная диагностика и научные исследования);
  • токсоплазмоз (в основном рутинная диагностика);
  • дирофиляриозы (эпидемиологические исследования);
  • простейшие кишечника (анализ водопроводной и питьевой воды).

Ограничения применения метода ПЦР при рутинной диагностике паразитозов связаны со сложным жизненным циклом паразитов, когда пара
зит на разных стадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяина и невозможно определить, какой материал оптимально пригоден для исследования.

Малярия

До настоящего времени выявление малярийных паразитов при микроскопическом изучении препаратов крови, окрашенных по Романовскому - Гимзе, в первую очередь препарата “толстая капля” крови, продолжает оставаться основным методом паразитологической диагностики малярии. Однако эффективность этого метода имеет свои ограничения. В первую очередь следует назвать исходно низкую паразитемию, а также относительно ограниченное количество исследуемой крови при дефектах приготовления “толстой капли”, что может препятствовать выявлению паразитов при их субмикроскопическом уровне. Еще одним ограничением является недостаточная квалификация персонала. Последнее имеет особое значение в случаях гипо- и гипердиагностики малярии. Все перечисленные ограничения микроскопии обусловили необходимость поиска методов диагностики малярии, не зависящих от квалификации микроскописта.

В настоящее время при малярийной инфекции метод ПЦР ограниченно применяется в диагностических целях, преимущественно при специальных исследованиях. Материалом в этих исследованиях обычно служит периферическая кровь, собранная на бумажные фильтры, или цельная кровь, что требует дополнительного взятия крови.

В Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского (далее - Институт) была разработана оригинальная методика ПЦР-диагностики малярийной инфекции, основанная на выделении ДНК из препарата крови “толстая капля”, уже использованного при микроскопическом исследовании, т. е. ранее окрашенного по Романовскому - Гимзе. Для уточнения порога чувствительности была проведена специальная серия исследований, при которых ДНК, выделенная из заведомо положительных “толстых капель” с паразитемией, подсчитанной на 1 мкл крови, последовательно разводилась. Данные ПЦР с разведенной ДНК позволили вычислить порог чувствительности, значения которого находились в пределах от 2 до 4 паразитов в 1 мкл крови.

Возможность использования препарата крови “толстая капля”, приготовленного для рутинных микроскопических исследований, в ПЦР повышает и расширяет роль и значение препаратов “толстая капля” в диагностике малярии и позволяет использовать эти препараты для ретроспективного контрольного исследования в целях исключения гиподиагностики малярии в очагах с низкой пораженностью населения.

В настоящее время на территорию РФ в нарастающем количестве происходит завоз vivax-малярии, регистрируются вторичные случаи от завозных. В меньшей степени наблюдается завоз falciparum-малярии. Подобная ситуация обусловливает большой объем исследуемых препаратов крови для раннего выявления больных малярией.

Большая опасность восстановления на территории РФ vivax-малярии связана с возможностью ее завоза лицами, прибывшими с территорий, эндемичных по этой видовой форме малярии, среди которых могут быть потенциальные паразитоносители, в т. ч. с субмикроскопическим уровнем паразитемии.

Высокая специфичность, чувствительность и автоматизированность метода ПЦР позволяют успешно использовать его как в диагностических целях, особенно в качестве референсного метода, так и при массовых обследованиях в очагах малярии, когда необходимо ежедневно микроскопировать сотни стекол. Преимущество ПЦР-диагностики малярии в референс-центрах заключается в возможности накопления клинического материала для постановки ПЦР 1 раз в 1-2 недели, что значительно сокращает трудозатраты.

В странах распространения лекарственно устойчивой тропической малярии (практически в разной степени все страны тропического и субтропического климата) и в случае ее завоза на территории, свободные от этой видовой формы малярии, необходимо проводить мониторинг за состоянием чувствительности P. falciparum к применяемым препаратам. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляет лекарственная устойчивость P. falciparum степени R1, когда после окончания лечения паразитемия достигает субмикроскопического уровня. Применение ПЦР-диагностики будет способствовать выявлению случаев R1 и тем самым оптимизировать мониторинг.

ПЦР-диагностика малярии имеет значительные преимущества в сравнении с микроскопической диагностикой не только по специфичности и чувствительности, но и по трудозатратам, особенно при массовых обследованиях. Так, микроскопия 100 препаратов крови требует для окончательного заключения в среднем 16,5 ч, что соответствует работе трех микроскопистов в течение рабочего дня. Использование ПЦР позволяет, при наличии одного термоциклера, выполнить эту работу одному человеку за один рабочий день.

Лейшманиозы

В последнее время в мире увеличилось количество лейшманиозов у людей, что связано с распространением паразитов в новые географические зоны. Также лейшманиозы являются оппортунистической инфекцией у лиц с иммунодефицитом, что меняет привычную эпидемическую картину.

В связи с возрастанием числа международных путешествий, являющихся причиной завоза паразитов, лейшманиозы регулярно диагностируются в регионах, где данная инфекция неэндемична. Диагноз может быть поставлен путем обнаружения паразита при микроскопии и при помощи серологических методов.

Висцеральные лейшманиозы обычно диагностируются с применением иммуносорбентного теста (ELISA) у иммунокомпетентных пациентов.

Однако чувствительность серологических методов у пациентов со СПИДом колеблется, по данным различных исследований, от 6 до 82%.

Прямое обнаружение паразита лучше всего достигается путем мультипликации промастиготных форм in vitro. Этот метод обладает большей чувствительностью, чем микроскопическое исследование биопсийного материала. Также культивация in vitro позволяет более подробно изучить культуру посредством изоферментного теста и получить важные сведения о чувствительности культуры к химиотерапии. Однако культивация in vitro может быть проведена только при наличии нативного материала.

Альтернативным методом диагностики является идентификация возбудителя при помощи молекулярно-биологических методов, таких как специфические ДНК-зонды или метод ПЦР. Были выделены несколько ДНК- мишеней, и их ценность для использования в ПЦР-диагностике постепенно возрастает.

В данный момент применение метода ПЦР оптимизировано для использования в рутинной клинической диагностике.

Токсоплазмоз

Токсоплазмоз - паразитарное заболевание, вызываемое простейшим Toxoplasma gondii. Это заболевание является одной из причин акушерской и детской патологии. При инфицированности в первый триместр беременности могут наступать тяжелые поражения с нарушением эмбриогенеза. При более позднем внутриутробном поражении плода органогенез проходит нормально, но воспалительные процессы в организме уже сформированного плода могут вызвать более или менее выраженные дефекты развития пораженных органов (фенопатии), особенно головного мозга и глаз: гидроцефалию, микроцефалию, микрофтальм и др.

Диагностика токсоплазмоза сложна и требует разносторонних исследований и квалифицированного персонала, что определило необходимость разработки ПЦР для диагностики токсоплазмоза. В настоящее время существует несколько тест-систем для диагностики токсоплазмоза как для традиционной ПЦР, так и для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

ПЦР-диагностика токсоплазмоза проводится наряду с иммуноферментным анализом во многих клинико-диагностических лабораториях. В качестве материала для анализа используются кровь и околоплодные воды.

Дирофиляриозы

Дирофиляриоз представляет собой уникальный для России гельминтоз, возбудитель которого на личиночной стадии развивается в организме переносчика - комаров родов Culex, Anopheles и Aedes. До недавнего времени проблеме выявления, лечения и профилактики дирофиляриоза в нашей стране уделялось мало внимания. Считалось, что это весьма редкий, не имеющий существенного медицинского значения гельминтоз, который в основном завозится к нам из других стран и территорий с более теплым климатом.

В последние 5 лет число больных, зарегистрированных в Российской Федерации, превысило 200 чел. Это не отражает истинной ситуации, т. к. дирофиляриоз не входит в число паразитозов, подлежащих официальной регистрации.

Для диагностики дирофиляриозов также используется метод ПЦР. D. repens имеет повторяющиеся участки ДНК, а D. immitis - кутикулярный антиген, которые могут быть использованы для диагностики этих видов ди- рофилярий с помощью ПЦР. Метод ПЦР позволяет идентифицировать особи гельминтов в очагах, где одновременно распространены разные виды дирофилярий.

Нами были выбраны и синтезированы праймеры для диагностики D. repens и D. immitis и подобраны режимы амплификации для этих праймеров. Испытания метода ПЦР-диагностики дирофиляриозов проводились на сыворотках крови собак с установленным диагнозом. Было проверено 10 положительных и 30 отрицательных сывороток. Полученные данные показали стопроцентную эффективность и чувствительность метода.

Также была отработана методика постановки ПЦР с использованием ДНК, выделенной из комаров родов Culex, Anopheles и Aedes. В более чем 10 районах Московской области собрано около 5 тыс. комаров. В настоящее время идет обработка собранного материала. На данный момент обработано менее половины, но уже есть 3 положительных результата: два D. repens и один D. immitis.

Кишечные протозоозы

В настоящее время методом ПЦР диагностируются амебиаз, крипто- споридиоз, лямблиоз и бластоцистоз.

До недавнего времени Blastocystis hominis не рассматривались как этиологический фактор патологических состояний человека. Более того, некоторые исследователи вообще сомневались в патогенных потенциях B. hominis и считали бластоцитоз не заболеванием, а безвредным транзи- торным носительством непатогенных микроорганизмов. Заболевания, вызванные B. hominis, обычно рассматривали как экзотические протозойные инфекции, связанные с путешествиями в тропические и субтропические страны.

В то же время и в странах с умеренным климатом поражения кишечника, обусловленные B. hominis, вовсе не так редки, как считали еще совсем недавно. В настоящее время эти паразиты обнаружены не только в Африке и Азии, но и в Европе, Северной и Южной Америке, Австралии, т. е. расселение В. hominis можно считать всесветным. В последние годы накоплено достаточное количество эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль B. hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма. Основными клиническими проявлениями бластоцистоза являются диарея и абдоминальные боли. Заболевание развивается по типу энтерита, энтероколита или колита.

Многочисленные сообщения убедительно свидетельствуют об этиологическом и патогенетическом значении бластоцист в развитии диарейного синдрома. Так, например, проведенное в 1986 г. в Югославии целенаправленное паразитологическое исследование подтвердило высокую частоту обнаружения бластоцист при хронических заболеваниях, когда диарейный синдром имел рецидивирующее течение и продолжался не менее одного месяца.

Особенно актуальной проблема бластоцистоза становится в связи с резким увеличением числа ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, т. к. у иммунокомпрометированных людей B. hominis легко вызывают хронические поражения пищеварительной системы.

Диагноз бластоцистоза ставится на основании микроскопического исследования методом нативного мазка. Однако диагностика бластоцистоза затруднена обилием различных морфологических форм бластоцист.

В Институте впервые в России была внедрена ПЦР-диагностика бла- стоцистоза, которая, наряду с методиками ПЦР-диагностики криптосори- диоза, лямблиоза и амебиаза, должна помочь в дифференциальной диагностике кишечных протозоозов.

С учетом специфики паразитарных болезней можно выделить следующие перспективные направления применения метода ПЦР в паразитологии: рутинная диагностика токсоплазмоза у беременных;

  • исследование переносчика дирофиляриоза на наличие микрофилярий (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
  • поиск внутривидовых различий малярийных паразитов, связанных с лекарственной устойчивостью малярийных паразитов, а также с длительностью инкубационного периода и возможностью возникновения рецидивов (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
  • рутинная диагностика малярии, лейшманиозов, трипаносомозов и ба- безиоза, особенно в сложных случаях с низкой паразитемией;
  • ретроспективный анализ препаратов на малярию и лейшманиозы с применением разработанной в Институте методики выделения ДНК малярийного паразита из окрашенных препаратов крови (используется только в референс-лабораториях);
  • выявление простейших кишечника (криптоспоридии, лямблии, бластоцисты, дизентерийные амебы) в клиническом материале и водных объектах окружающей среды;
  • дифференциальная диагностика диарей неясной этиологии при подозрении на паразитарную патологию.

Таким образом, молекулярно-биологические методы имеют значительные перспективы в паразитологии - как в научных исследованиях, так и в практическом здравоохранении.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.