text

🎁 Журнал+чайник в ПОДАРОК! УСПЕТЬ ➤➤➤

Здравоохранение

Современная стратегия лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций, ассоциированных с перинатальной патологией (продолжение)

  • 15 мая 2011
  • 81

Современные методы лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций

По своей информативности методы лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций подразделяют на две группы:

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

  1. прямые методы, направленные на выявление возбудителя (вирусологический), его антигенов (реакция иммунофлуоресценции - РИФ, биочиповая технология) или вирусного генома - ДНК (метод ПЦР);
  2. непрямые (серологические) методы: иммуноферментный анализ (при скрининговых и диагностических исследованиях направлен на выявление антител в сыворотке крови, плазме, спинномозговой жидкости и др.); РИФ; им- муноблот (Western-blot, Line-blot), используемый для подтверждения результатов иммуноферментного анализа либо в сложных диагностических случаях внутриутробной инфекции; биочиповые технологии.

При ЦМВ-инфекции, герпетической инфекции и ВЭБ-инфекции для установления активности инфекционного процесса следует:

  • принимать во внимание отнесение женщины (новорожденного) к определенной группе риска и особенности формирования иммунного ответа беременных и новорожденных;
  • учитывать диагностически значимую динамику либо смену антител одного класса другим, если это позволяет временной фактор и не требуется оперативной диагностики в связи с состоянием здоровья ребенка; использовать комплекс лабораторных тестов (особенно в случае необходимости быстрой диагностики), включая выявление вирусного генома (ДНК) либо антигенов - “ранних белков” вируса, антител класса IgM, IgA и низкоавидных IgG;
  • установить (исключить) сочетанное инфицирование;
  • выявить факторы риска инфицирования плода (новорожденного) и развития осложнений.

При подозрении на внутриутробное инфицирование целесообразно провести исследование на обнаружение маркеров следующих инфекций: ЦМВ, ВПГ, ВЭБ, ВГЧ-6. Получение отрицательных результатов при обследовании матери во время беременности в большинстве случаев позволяет исключить инфекции и в дальнейшем проводить прицельное обследование ребенка. Однако надо помнить и о возможности заражения женщины в поздние сроки беременности, что при хронической фетоплацентарной недостаточности и вторичном иммунодефиците (в т. ч. ВИЧ-инфекции) приводит к заражению плода (новорожденного).

В случаях, когда мать ребенка не была ранее обследована, в целях оперативной и более точной диагностики внутриутробной инфекции, рекомендуется проводить параллельное исследование крови матери и ребенка. Именно в процессе диагностики неонатальной патологии наибольшее диагностическое значение имеют дополнительные тесты: детекция IgM, IgA, антигенов - “ранних белков” либо ДНК возбудителя.

Выявление только IgG является малоинформативным вследствие циркуляции материнских антител, полученных ребенком трансплацентарно (“иммунный вклад беременной женщины”). Обнаружение специфических антител класса IgM и/или IgA у детей раннего возраста однозначно указывает на инфицированность ребенка (через плаценту IgM и IgA не передаются, являются собственными антителами ребенка, нарабатываемыми его организмом в присутствии антигенов возбудителя).

Причинами ложноотрицательного результата серологического исследования на обнаружение IgM могут быть:

  • иммунологическая толерантность, которая не носит постоянного характера и может возникнуть при антигенной перегрузке;
  • влияние высокой концентрации материнских антител класса IgG маскирует наличие IgM и собственных IgG у ребенка. У серонегативных детей с врожденной инфекцией специфические IgM могут появиться в сыворотке (плазме) крови в более позднем периоде (на 6-8-м месяцах жизни); усиленная антигенная стимуляция иммунной системы при сочетанном инфицировании и в случае активной герпесвирусной инфекции.

Лабораторная диагностика герпетической инфекции

При типично протекающей герпетической инфекции нет необходимости в ее лабораторном подтверждении, но важно установить (исключить) вирусно-бактериальную микст-инфекцию, а также выявить имеющиеся факторы риска. Целесообразными являются диагностические исследования при подозрении на ВПГ-инфекцию в атипичных случаях, при наличии в анамнезе пациента указаний на присутствие рецидивирующей инфекции либо на дебют герпетической инфекции в период течения беременности.

Поскольку выявление антител класса IgG к ВПГ имеет крайне низкое диагностическое значение, то предпочтительнее использовать диагностические методы, направленные на выявление лабораторных маркеров. В их числе:

  • выявление ВПГ-IgM, желательно и IgA - для всех беременных женщин (сплошной скрининг);
  • детекция в лейкоцитарной взвеси ДНК либо антигенов (“ранних белков”) вируса, ВПГ-IgM, IgA - для беременных высокого инфекционного риска;
  • детекция в лейкоцитарной взвеси (ликворе) ДНК либо антигенов (“ранних белков”) вируса, IgM, IgA - для новорожденных с подозрением на внутриутробную ВПГ-инфекцию.

При клинико-лабораторном мониторинге инфекции оказалось, что тест на авидность ВПГ-IgG несет низкую информационную нагрузку: реактивация при клинически выраженных случаях сопровождалась наличием высокоавидных антител. В связи с чем их определение у взрослых нецелесообразно.

Исследуемым материалом служат: кровь (сыворотка либо плазма), ликвор (по показаниям), соскобы. Метод ПЦР позволяет детектировать вирусную ДНК, а РИФ - выявить антигены (“ранние белки”) непосредственно в лейкоцитарной взвеси, соскобах, взятых у лиц, находящихся в очагах поражения (со слизистых, конъюнктивы, кожи), ликворе. Выявление ДНК или ранних белков ВПГ-1 и ВПГ-2 в лейкоцитах крови свидетельствует о репликации вируса.

Наибольшее диагностическое значение имеет детекция IgM как показателя активности процесса, что может свидетельствовать об остром заболевании, реинфекции, суперинфекции или реактивации. Однако в клинически выраженных случаях, в т. ч. при типичном течении неонатального герпеса, специфические IgM выявляются редко (при скрининге - в 3-6% случаев). Решающее значение в диагностическом плане имеет выявление ВПГ-IgA и ДНК или “ранних” антигенов ВПГ. Целесообразность определения IgA к ВПГ-1 и ВПГ-2 доказана наличием сильной положительной корреляции между их высоким уровнем (выше 3,2 Ед/мл) и реактивацией, клиническим эквивалентом которой являлось появление типичных высыпаний герпеса или развитие неонатального герпеса.

Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции

При лабораторной диагностике ЦМВ-инфекции предпочтительно использовать следующие методы, направленные на выявление таких лабораторных маркеров, как:

  • ЦМВ-IgM и низкоавидных IgG - у беременных женщин (сплошной скрининг);
  • детекция в лейкоцитарной взвеси ДНК либо антигенов (“ранних белков”, в т. ч. белка р72) вируса, ЦМВ-IgM, ЦМВ-IgA - у беременных высокого инфекционного риска;
  • детекция в лейкоцитарной взвеси ДНК либо антигенов (“ранних белков”) ЦМВ, ЦМВ-IgM, ЦМВ-IgA; при сомнительных результатах даже в случае отсутствия специфических IgM дополнительную диагностическую информацию может дать иммуноблот, позволяющий выявить антитела IgM к отдельным белкам ЦМВ - у новорожденных с подозрением на внутриутробную ЦМВ-инфекцию.

Для вышеперечисленных методов используется следующий биологический материал: кровь (сыворотка, плазма), моча (новорожденного), слюна (новорожденного), ликвор (по показаниям).

Рекомендуется также использовать “быстрый культуральный метод” с предварительным внесением биоматериала в культуру фибробластов и выявлением цитопатического действия ЦМВ (его “ранних белков”) в РИФ. Наличие ДНК или ранних белков ЦМВ в лейкоцитах крови следует рассматривать как тест высокой диагностической значимости. Если при обследовании родившегося от ЦМВ-инфицированной матери ребенка в течение первой недели жизни методом РИФ не выделены антигены вируса, а затем обнаружены в период первого года жизни, начиная со 2-й недели до 6 месяцев, то можно сделать заключение о наличии перинатальной ЦМВ- инфекции. Высокоинформативным тестом является также исследование мочи на наличие ДНК или антигена p72. Именно этот тест рекомендуется использовать в процессе мониторинга здоровья детей первого года жизни, т. е. для исключения ЦМВ-инфекции. Неинвазивный способ получения материала для исследования определяет его преимущество.

В клинической практике наибольшее диагностическое значение имеет обнаружение IgM - индикатора активности процесса, что может свидетельствовать о наличии острого заболевания, реинфекции, суперинфекции или реактивации. У многих пациентов с выраженным иммунодефицитом и тяжелым проявлением ЦМВ-инфекции, а также у беременных и детей раннего возраста, выработка антител к ЦМВ замедлена, что проявляется обнаружением специфических антител в низкой концентрации или отсутствием положительной динамики антител. В этих случаях решающее диагностическое значение имеет выявление IgA, “ранних” IgG-антител (низкоавидных антител) и/или “ранних” антигенов либо ДНК ЦМВ. Показатель авидности менее 40% может указывать на наличие первичной ЦМВ-инфекции.

Иммуноблот позволяет раздельно детектировать IgM и IgG к отдельным белкам ЦМВ, следить в динамике за сменой белков, что имеет высокое диагностическое и прогностическое значение. Специфичность антигенов представлена в табл. 2. Антигены ЦМВ подразделяют на три категории:

  • перекрестнореагирующий антиген с молекулярной массой 65 кДа и неопределенные антигены;
  • низкоспецифичные антигены с молекулярными массами 55, 52 и 38 кДа; высокоспецифичные антигены с молекулярными массами 130 и 28 кДа.

Таблица 2

Специфичность и оценка значимости антигенов ЦМВ в иммуноблоте

Полоса на стрипе

Антиген

Описание

Категория

значимости

130 кДа

pp130

Фосфопротеиновый антиген: UL57

3

65 кДа

pp65

Тегументный фосфопротеиновый антиген (протеин оболочки): UL83

1

55 кДа

p55

Гликопротеин В антиген gB: UL55

2

52 кДа

РР52

Фосфопротеиновый антиген: UL44

2

38 кДа

p38

Специфичный антиген

2

28 кДа

p28

Капсидный протеиновый антиген: UL99

3

Наличие высокоспецифичных антигенов подтверждает формирование иммунного ответа к ЦМВ, а наличие хотя бы одной полосы категории 3 (pp130 и p28) свидетельствует о положительном результате. Присутствие рр65 (предранний белок) расценивается как маркер первичной (острой) инфекции или реактивации. Однако не исключается наработка этого белка и при суперинфекции. По мере развития инфекционного процесса появляется p28.

У ВИЧ-инфицированных женщин и новорожденных исчезновение одних и появление других - “ранних” белков, обнаруживаемых в процессе диагностики, может оказать существенную помощь лечащему врачу в плане прогноза развития генерализованной ЦМВ-инфекции. Высокую значимость имеют детекция ДНК и выявление ЦМВ-IgA.

Лабораторная диагностика ВЭБ-инфекции

Диагностика основывается как на клинических, эпидемиологических, так и на лабораторных данных. В связи с выраженным полиморфизмом клинических проявлений большое диагностическое значение имеет правильная оценка обнаруживаемых изменений в крови. Для подтверждения диагноза используются метод ПЦР и серологические методы. Наибольшее значение имеет обнаружение ДНК в плазме крови либо в соскобе ткани, взятой из носоглоточного кольца. Дополнительно можно использовать выявление антител класса IgM к вирусному капсиду и “ранних” IgG. При обнаружении IgM можно делать заключение об остром характере течения инфекции, в случае выявления “ранних” IgG - о реактивации вируса. Антитела к ядерным антигенам вируса IgG появляются лишь через 3-6 недель от начала болезни и сохраняются в течение всей жизни человека. Определение этих антител имеет ретроспективное значение, применение его для обследования беременных и новорожденных не обоснованно.

Диагностическое значение имеет обнаружение широкоплазменных атипичных мононуклеаров при увеличении общего числа лимфоцитов. Дополнительную информацию также дает результат иммуноблота по определению IgM и IgG к отдельным белкам, что позволяет более точно определять фазу течения инфекции, учитывая высокую частоту персистенции вируса. Выявление белка VCA 125 указывает на раннюю фазу течения инфекции. В период разгара течения инфекции и на этапе завершения острого процесса появляются VCA 19. О поздней фазе течения инфекции свидетельствует обнаружение высокоспецифичного маркера VCA 22, который выявляется одиночно или совместно с EBNA-1 (р79). Последний белок длительно присутствует у лиц, переболевших инфекцией, и убедительно свидетельствует о перенесенной инфекции. Использование в нашей практике иммуноблота показало частое присутствие ^М-р45 (42,4%) и IgM-p79 (36,3%) при активности процесса, IgM-p43 и IgG-p27 имело прямую корреляцию с тяжестью течения инфекции, а синтез IgM-p65, IgM-p33 - с наличием гепато- и спленомегалии.

Лабораторная диагностика ВГЧ-6-инфекции

Верификация диагноза ВГЧ-6-инфекции осуществляется только при положительных результатах лабораторных исследований. Исследуемым материалом служат кровь (плазма), слюна, ликвор. Основным методом дифференциальной диагностики является ПЦР, позволяющая детектировать ДНК ВГЧ-6. В современных условиях имеется возможность выявления антигенов данного вируса методом РИФ и антител класса IgA к ВГЧ-6. Индикаторами активной инфекции служат ДНК, антигены - “ранние белки” данного вируса и наличие специфических IgA.

Оценка цитокиновой регуляции при герпесвирусных инфекциях

В последние годы в поисках диагностических и прогностических критериев предлагается проводить оценку состояния цитокиновой системы в норме и при патологиях. В диагностической практике наибольшее значение имеет определение уровня фактора некроза опухоли (ФНО)-а, интерлейкинов: ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, интерферонов. Наиболее глубокие изменения иммунореактивности выявлены у пациентов с рецидивирующей ЦМВ-, ВЭБ- и ВПГ-инфекцией.

В нашей практике установлено, что у 15% от числа обследуемых женщин, беременность которых завершилась внутриутробной гибелью плода, при наличии верифицированной герпесвирусной инфекции, протекающей как в форме моноинфекции, так и в форме вирусно-бактериальной инфекции, обнаруживалось низкое содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-16 и ФНО-а. Именно с этим и связана необеспеченность адекватного иммунного реагирования организма на антигенную нагрузку, сопряженная с иммунодефицитом. Однако у большинства обследованных нами женщин на фоне течения патологического процесса отмечается значительное увеличение этих провоспалительных цитокинов. Углубленная оценка интер- фероновой системы показала, что на фоне выраженной активности возбудителя имеется своеобразный дисбаланс: сывороточный (спонтанный) интерферон-у чаще определялся на уровне контрольных значений на фоне резкого снижения продукции стимулированного интерферона-у, что, по нашему мнению, является свидетельством депрессии данной системы.

При обследовании женщин, беременность которых завершилась внутриутробной гибелью плода (несостоявшийся выкидыш), было установлено, что в качестве прогностических критериев развития системной воспалительной реакции, независимо от срока гестации, могут выступать цитокины (ФНО-а, РАИЛ, ИЛ-8, ИЛ-10) и лактоферрин, что обосновывает целесообразность их включения в диагностический процесс.

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости разработки рационального подхода к лабораторной диагностике герпес- и цитомегало- вирусной инфекций и пересмотра существующей системы эпидемиологического и клинико-лабораторного мониторинга перинатальной патологии инфекционного генеза, что позволит сосредоточить внимание на группах высокого риска.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.