text
Портал для медицинских работников

Методы диагностики микозов

  • 15 октября 2011
  • 358

К концу первого десятилетия XXI в. во всем мире отчетливо проявились изменения в иерархической структуре патогенов, вызывающих наиболее опасные инфекции человека. Если раньше пальма первенства принадлежала бактериальным инфекциям, среди которых наибольший удельный вес имели кишечные и бронхолегочные заболевания, то сегодня более чем столетняя история применения антимикробных препаратов, рост инвазивных манипуляций, иммунотропная терапия и иммунопрофилактика, а также возрастание в человеческой популяции иммунодепрессивных заболеваний и состояний привели к смещению видового состава возбудителей в сторону грибковых и вирусных патогенов. Медицинская и цивилизационная селекция способствовали отбору микроорганизмов с наиболее широким спектром генетически обусловленных приспособительных реакций, к числу которых относятся грибы.

С точки зрения клинической лабораторной диагностики, целесообразно учитывать уровень патогенности - степень биологической угрозы, которую представляет тот или иной гриб. В клинической практике прогностическая значимость той или иной микологической инфекции определяется риском развития системных патологических процессов, приводящих к смерти пациента.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

В связи с высоким риском развития системных процессов на фоне широкого распространения микроорганизмов наибольшее значение в клинической практике имеют грибы, относящиеся к трем родам: Aspergillus, Cryptococcus и Candida. Особенность кандидоза как наиболее частой эндогенной оппортунистической инфекции обусловлена широким распространением кандидоносительства в здоровой популяции. Исследование с участием взрослых здоровых добровольцев показало, что Candida albicans присутствует в орофарингеальной зоне у 20-30% из них, в тонком кишечнике - у 50-54%, в толстом кишечнике - у 55-70% и в фекалиях - у 65-70%.

При исследовании состава микрофлоры полости рта у населения нескольких стран Европы присутствие грибов обнаружено у 10-25% жителей.

Грибы Candida, являясь нормальными комменсалами желудочнокишечного тракта, становятся патогенными в случаях снижения Т-клеточ- ного иммунитета, макрофагального и нейтрофильного фагоцитоза, повышения способности грибов к адгезии и инвазии. У пациентов с ВИЧ и больных с нейтропенией, у которых фагоцитоз резко подавлен, местная инвазия и диссеминация инфекции наступают очень быстро. Наиболее угрожающим и зачастую фатальным последствием диссеминации кандидозной инфекции является кандидемия и, как следствие, кандидозный сепсис.

Наиболее значимым фактором риска системного кандидоза и высокого уровня летальности у пациентов с иммунодефицитом является колонизация грибами рода Candida двух и более локусов. Считается, что выделение дрожжевых грибов из двух и более областей указывает на иммуносупрессию и повышенную вероятность развития системного кандидоза и является более точным прогностическим фактором диссеминации по сравнению с посевами крови.

В ходе многофакторного анализа методом логистической регрессии было показано, что колонизация Candida spp. многих локусов (например полости рта, кишечника, влагалища), наряду с такими факторами риска, как предшествующий гемодиализ, парентеральное питание, наличие центрального венозного катетера, особенно трехходового, достоверно влияет на возникновение инвазивного кандидоза.

В настоящее время системный кандидоз занимает лидирующее положение среди причин заболеваемости и смертности, связанных с микологическими инфекциями. Так, Candida spp. занимает в США 4-е место среди внутрибольничных инфекций (ВБИ), вызывающих септицемию, составляя примерно 10% всех ВБИ. Смертность от системного кандидоза достигает 40% от числа выявленных случаев, причем ежегодно регистририруют от 2800 до почти 10 тыс. смертей. Стоимость ведения одного больного с кан- дидемией оценивается в пределах от 6214 до 45 602 долл..

Физиология дрожжевых грибов

Грибы - аэробные организмы, являющиеся гетеротрофами, они не способны к фотосинтезу, неподвижны, питание осуществляют с помощью абсорбции из окружающей среды. Такой тип питания предполагает рост гриба на источнике питательных веществ или внутри него. Большая площадь всасывающей поверхности создается сетью гиф. Нерастворимые вещества, например кератин, грибы переваривают с помощью экзоферментов за пределами клетки. Азот, сера, фосфор и ионы магния и других металлов составляют основу питания гриба. Интенсивность роста грибов зависит, наряду с прочим, от концентрации питательных веществ; часто его лимитирует источник углерода.

Жизненный цикл гриба можно охарактеризовать следующими этапами: прорастание и распространение или размножение. Рост и развитие грибной колонии изменяют окружающую среду. Она может обедняться питательными веществами, высыхать или разжижаться; наряду со сдвигами рН, окислительно-восстановительного потенциала и осмолярности, начинают влиять ингибирующие (антибиотики) и стимулирующие факторы (ростовые факторы, гормоны). Отклоняются от исходных значений концентрации кислорода и двуокиси углерода. Выживанию грибов это обычно не угрожает, т. к. вследствие эволюционного отбора у них сформировались реакции на изменяющиеся условия существования. Физиологические ограничения (постепенное высыхание, дефицит отдельных компонентов питания и т. д.), как правило, вызывают переход от первичного метаболизма к вторичному, т. е. обычно к образованию покоящихся и репродуктивных органов.

Если условия изменяются незначительно и постепенно, формы гриба модифицируются так же плавно, затрагивая лишь незначительные части таллома. При глубоких или длительных изменениях среды происходят качественные перестройки метаболизма. По мнению крупнейших мировых исследователей физиологии грибов Э. Мюллера и В. Леффлера, применение критерия причинно-следственных связей недостаточно для оценки экологии грибов (естественные условия жизни и взаимоотношения с другими компонентами биоценоза, включая макроорганизм человека). Согласуются ли друг с другом разные функции, очевидно, определяется естественным отбором в ходе филогенетического развития. Однако в отдельных случаях грибы ведут себя не по правилам математически рассчитанной эффективности. Например, образование больших количеств конидий одним грибом будет явно неэкономным с точки зрения энергозатрат, если ему не соответствуют условия прорастания или распространения. То есть ответной реакцией гриба на ухудшение условий окружающей среды становится активное формирование “переживающих структур”, а не перевод метаболизма в “дремлющую фазу”. Вариабельность ответных реакций грибов на изменения различных параметров среды обитания является источником многочисленных диагностических и прогностических ошибок, а также неправильной оценки эффективности терапии.

Нормативное регулирование микологических исследований

Приказ Минздрава России от 21.03.2003 № 116 “О враче - клиническом микологе и враче - лабораторном микологе”, выделивший лабораторную микологию отдельной специальностью, требующей профессиональной переподготовки и сертификации, был отменен приказом Минздравсоцразвития России от 04.03.2011 № 167 “О признании утратившими силу приказов Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также отдельных положений приказов Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации”.

Единая нормативная база лабораторной микологии до настоящего времени не создана. В практической деятельности приходится опираться на разрозненные, часто противоречащие друг другу положения, содержащиеся в приказах Минздрава России и Минздрава СССР. Отсутствие единой, стройной и последовательной нормативной базы приводит к прецедентной методике преподавания лабораторной микологии и применения правоустанавливающих документов в клинических лабораториях.

Данные о методах лабораторной диагностики микозов содержатся в приказах Минздрава России от 21.02.2000 № 64 “Об утверждении Номенклатуры клинических лабораторных исследований”, Минздравсоцразвития России от 03.03.2011 № 166н «О мерах по реализации постановления Правительства РФ от 31 декабря 2010 г. № 1235 “О финансовом обеспечении за счет средств федерального бюджета мероприятий, направленных на обследование населения с целью выявления туберкулеза, лечения больных туберкулезом, а также профилактических мероприятий”», Минздрава СССР от 23.04.1985 № 545 “О дальнейшем совершенствовании контроля качества клинических лабораторных исследований”, Минздравсоцразвития России от 09.07.2007 № 474 “Стандарт медицинской помощи больным болезнью, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)” и от 09.07.2007 № 475 “Стандарт медицинской помощи больным болезнью, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (при оказании специализированной помощи)”, а также других нормативных актах, перечислить которые в рамках одной статьи не представляется возможным.

Микроскопические исследования

В настоящее время микроскопические исследования осуществляются в КДЛ при первичном обследовании лиц с подозрением на заболевание микозом. Зачастую микроскопическое исследование составляет диагностический минимум, дополняя клинико-анамнестические данные пациента. Однако следует помнить, что результаты микроскопии не могут быть единственным основанием при постановке клинического диагноза.

Хотя микроскопическое исследование до настоящего времени является обязательным, его информативная ценность, в зависимости от нозологической формы микоза и характера исследуемого биологического материала, значительно различается. В крови, спинномозговой жидкости, костном мозге и других в норме стерильных биологических жидкостях возбудитель может присутствовать в очень малых количествах, недостаточных для визуализации. Кроме того, особенности жизненного цикла дрожжевых грибов делают их пребывание в центральном кровотоке очень кратковременным (“пульсирующие” выбросы), что также затрудняет верификацию диагноза методом микроскопии.

Резко различается трактовка полученных результатов в случае обнаружения грибов - абсолютных патогенов и условно патогенной микофлоры, особенно если материалом для исследования служат кожа и слизистые оболочки - поверхности, являющиеся в норме нестерильными. Микроскопия может считаться качественным методом исследования при обнаружении грибов в стерильных в норме биологических средах организма и в материале органов и тканей.

При исследовании нестерильных субстратов на наличие условно патогенных грибов, в т. ч. дрожжевых грибов рода Candida, трактовка результатов микроскопии более разноречива. Нахождение оппортунистической флоры в больших количествах, свидетельствующих о массивной колонизации субстрата, можно считать основанием для проведения культурального исследования. Микроскопия не позволяет осуществить родовую идентификацию возбудителя, что негативно отражается на выборе тактики терапии и приводит к хронизации микоза и отбору и накоплению резистентных штаммов в популяции.

Приготовление мазков из нативного материала

При приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании. Не рекомендуется готовить мазки способом “растяжки” материала между двумя предметными стеклами. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.

Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный на расстоянии 5-10 см от стекла. Ограниченная площадь мазка (приблизительно 1 х 2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность манипуляции и последующей микроскопии, т. к. периферические части и ребра предметного стекла остаются не загрязненными инфекционным материалом.

Микроскопия нативных препаратов

Перед проведением исследования плотного биологического материала необходимо измельчить крупные фрагменты и произвести просветление препарата. Жидкий биологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в воде, изотоническом растворе или с применением просветления.

На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 1 каплю материала, затем 2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом.

Микроскопируют вначале при увеличении х400, дающем возможность увидеть скопления клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы гриба, а затем при большом увеличении (х1000 с масляной иммерсией), когда возможно характеризовать отдельные клетки.

Методики просветления плотного нативного препарата

При исследовании тканей с высоким содержанием кератина просветление препарата осуществляют добавлением капли 10-20%-ного раствора щелочи (КОН или NaOH). Экспозиция чешуек кожи осуществляется в течение 2 ч, волос - 30-40 мин, ногтей - 24 ч. Подогревание патологического материала перед микроскопированием не рекомендуется, т. к. это может привести к выпадению кристаллического осадка солей кальция, затрудняющего исследование (микроскопически сходного со спорами), и разрушению грибковых элементов.

Для просветления можно использовать также смесь спирта с глицерином (спирта и глицерина - по 2 части, воды - 4 части) или раствор Люголя двойной крепости (кристаллического йода - 1 г, йодистого калия - 2 г, воды - 150 мл). На исследуемый инокулят (чешуйки, соскобы с кожи и высыпаний, волосы) наносят каплю 10%-ного КОН, или смеси спирта с глицерином, или раствора Люголя двойной крепости. Препарат накрывают покровным стеклом. Экспозиция проводится по указанным временным интервалам.

Методика обогащения

Методика обогащения применяется для выявления грибов в тканях, богатых кератином, - роговых чешуйках кожи и ногтях. Исследуемый материал, помещенный в центрифужную пробирку, заливают 20-30%-ным раствором КОН на 10-12 ч (чешуйки кожи) и 24 ч (ногти). Полученную гомогенную желеобразную массу тщательно перемешивают и помещают хорошо просветленный патологический материал на предметное стекло. Критерием хорошей подготовки материала считается потеря им очертаний и расплющивание при сдавливании между предметным и покровным стеклами.

Материал для нативного микроскопического исследования на дрожжевые грибы весьма разнообразен - это могут быть соскобы с кожи, слизистых оболочек, элементы кожной сыпи, различные экскреты (мокрота, моча, кал, сок простаты), ликвор, кровь. Однако вероятность обнаружения грибов в различных биологических субстратах существенно отличается.

Микроскопия окрашенного препарата

Для окраски препарата при исследовании на дрожжевые грибы в рутинной лабораторной практике наиболее часто используются простые методы (водный или спиртовый раствор метиленового синего 1%, раствор метиленового синего с лактофенолом, водный раствор фуксина 1%, спиртовой раствор генцианвиолета 1%). Из сложных дифференциальных методов окраски наиболее распространена окраска гематоксилин-эозином по Граму.

Дрожжеподобные грибы (псевдомицелий, дрожжевые клетки) грам-отрицательны и окрашиваются в ярко-фиолетовый цвет.

Во всех модификациях окраски по Граму лучше всего окрашиваются молодые (почкующиеся и ветвящиеся) формы гриба с рыхлой клеточной стенкой. Нитчатые структуры видны менее отчетливо, а иногда и совсем не окрашиваются. Кроме того, отрицательной стороной окраски по Граму является значительное количество артефактов, в результате чего некоторые тканевые структуры (например, фибрин в материале язвенного дефекта) могут быть приняты за грибы. Избежать этой неоднозначности в интерпретации результатов микроскопии позволяет окраска препарата по Брауну - Бренну.

В настоящее время наиболее употребительными в рутинной лабораторной практике являются методы окраски метиленовым синим и по Граму. Такой выбор оправдан простотой методики, отсутствием многоэтапной длительной процедуры окрашивания, четкостью и контрастностью получаемого микроскопического препарата, небольшими трудозатратами на проведение исследования.

При просмотре препаратов, содержащих большое количество фибрина, богатый клеточный материал, желательны применение окраски по Брауну - Бренну и ШИК-реакция (PAS-реакция).

В практике исследования биоматериала из бронхо-легочного тракта (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж) рекомендовано дополнительное использование ШИК-реакции для выявления истинных грибов-эумице- тов и окраска по Цилю - Нильсену, или модификация по методу Киньона для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, в первую очередь микобактерий туберкулеза, возбудителей лепры - микобактерий Хансена, нокардий и спорообразующих дрожжей.

При микроскопическом исследовании препаратов - отпечатков органов, центрифугатов, гистологических срезов рекомендуется осуществлять окраску биологического материала тремя методами (приказ Минздрава России от 21.03.2003 № 109 “О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации”):

  • окраска PAS-методом (ШИК-реакция);
  • окраска по Граму или в модификациях по Граму - Вейгерту, по Боголепову, методом Брауна - Бренна для выявления сопутствующей бактериальной микробиоты, актиномицетов и нокардий;
  • окраска по Цилю - Нильсену, или модификация по методу Киньона для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, нокардий и спорообразующих дрожжей.

ШИК-реакция - окраска на нейтральные полисахариды

Данный метод окраски основан на выявлении в стенках грибов нейтральных полисахаридов при окислении гликалиевых групп углеводов йодной или хромовой кислотой. В стенках всех эумицетов (истинных грибов) в той или иной концентрации имеется глюкан-маннановый комплекс. При окраске материала, содержащего грибы, фуксинсернистой кислотой происходит окрашивание стенки гриба в пурпурно-красный или фиолетовый цвет. Считают, что в основном окрашивается маннан, глюкан PAS-отрицателен, а хитин дает слабую непостоянную окраску. Благодаря высокой концентрации полисахаридов в клеточных стенках грибов их окраска значительно ярче, чем окружающие их биологические среды человеческого организма.

В настоящее время установлено, что эумицеты PAS-положительны и хорошо окрашиваются, причем как вегетирующие, так и дегенеративные, в т. ч. и фагоцитированные элементы гриба. Прокариоты являются PAS-отрицательными.

В лабораторной практике в настоящее время используются модификации PAS-метода: окраска по Хочкиссу - Мак-Манусу и окраска по Шаба- дашу. Значительным недостатком окраски по Хочкиссу - Мак-Манусу является быстрое разложение йодной кислоты. Этого недостатка лишена методика окраски на полисахариды по Шабадашу с применением перйодата калия. При окраске этими методами грибы окрашиваются в красно-фиолетовый или пурпурный цвет, ядра клеток синевато-серого цвета, общий фон бледно-фиолетовый. Недостатком методики является интенсивное окрашивание тканевых элементов, наиболее выраженное в очагах распада.

При окраске по Гридли удается получить яркое контрастное окрашивание грибов, в т. ч. и грамотрицательных. Нити окрашиваются в темно-голубой цвет, споры приобретают оттенки от темно-розового до пурпурного, общий фон желтый. Лучше всего окрашиваются псевдомицелий и стенки эндоспор.

Преимущества окраски по Шабадашу и по Гридли: грибы равномерно окрашиваются, четко выявляются их фагоцитированные элементы, окрашиваются также и их мертвые частицы.

Окраска по Шабадашу и Хочкису - Мак-Манусу хорошо выявляет молодые формы грибов, особенно эндоспоры и бластоспоры, что позволяет успешно дифференцировать вид возбудителя. Однако в дегенеративно измененных формах некоторых грибов (например криптококков) содержание полисахаридов снижается, и поэтому окраска на полисахариды не всегда дает положительные результаты.

Так как при этих методиках окрашиваются тканевые элементы, некоторые бактерии, богатые полисахаридами, необходимо параллельно окрашивать препараты гематоксилин-эозином, чтобы дифференцировать грибы от тканевых элементов.

Методы окраски флуоресцирующими красителями

Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии, исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь поля зрения.

Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (грибковые клетки), окрашенные специальными красителями (флуорохро- мами), под действием облучения их ультрафиолетом испускают излучение в видимом спектре света. Так как собственная флуоресценция грибов невелика, для ее усиления применяют красители акридиновый желтый или акридиновый оранжевый.

За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим окрашенные флуорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении х250 - х450, тогда как окрашенные обычными красителями - при увеличении х800 - х1000. Разница в увеличении позволяет одновременно держать в поле зрения в 4-10 раз большую площадь, что существенно сокращает время, необходимое для микроско- пиии мазка. Наряду с этим при люминесцентной микроскопии отмечается большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает комфортность микроскопического исследования. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании материала с малым содержанием грибковых клеток.

При окраске флуорохромными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться фильтровальной бумагой. Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, т. к. водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флуоресценцию.

Микроскопию производят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски люминесцентными красителями и высыхания мазков. В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флуоресценции. При окраске мазков необходимо избегать толстых мазков, т. к. это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

При окраске мазков не следует помещать на штатив (“рельсы”) и окрашивать одновременно более 12 стекол. Соприкосновение стекол боковыми краями может привести к переносу краски и контаминации микроорганизмами с одного стекла на соседние.

Окрашенные для исследования флуорохромными красителями мазки непригодны, если при окраске:

  • в положительном контрольном мазке не обнаруживаются ярко окрашенные бактериальные клетки или они имеют тусклую флуоресценцию; отрицательные контрольные мазки содержат флуоресцирующие объекты;
  • фон недостаточно темный или имеет флуоресцентное свечение.

Препараты просматривают в обычном световом микроскопе с электроосветителем. В качестве входного на конденсере используют голубой, а в качестве окулярного - желтый фильтры, которые подбирают таким образом, чтобы они полностью перекрещивались.

Одной из важных особенностей работы с мазками, окрашенными флуо- рохромами, является то, что они не подлежат длительному наблюдению в выбранном поле зрения, т. к. интенсивность люминесценции окрашенного объекта быстро снижается.

Метод флуоресцирующих антител (реакция иммунофлуоресценции, иммунофлуоресцентный анализ)

Наибольшее распространение метод флуоресцирующих антител имеет при исследовании биологических жидкостей (преимущественно бронхоальвеолярный лаваж). С его помощью можно обнаружить корпускулярные грибные антигены, установить наличие и локализацию антигенов, высвободившихся при разрушении грибов в организме. Метод основан на реакции “антиген - антитело” с использованием антител, коньюгированных с флюоресцентным красителем.

Недостатком метода является необходимость иметь для диагностики каждого вида, а иногда и штамма гриба, соответствующую сыворотку, содержащую высокоавидные антитела. При диагностике микозов с неизвестным возбудителем в лаборатории необходимо иметь набор готовых иммунных высокоспецифичных сывороток против различных наиболее распространенных паразитирующих грибов, что значительно увеличивает стоимость исследования и трудозатраты и возможно только в условиях крупных профильных лечебных учреждений.

Методы окраски, применяемые при микроскопической идентификации дрожжевых грибов (Номенклатура лабораторных исследований, 2000 г.)

Гематоксилин

эозином

По Ван-Гизону

PAS,

различные

модификации

По Гридли

По Гомори - Грокотту

Акридиновым

оранжевым

Флуоресцир. а/телами

По Граму

По Грам - Вейгерту

По Брауну - Бренну

По Романовскому - Гимзе

По Райту

Альциановым синим

По Бауэру

Мукарцином по Мейеру

У

s *

S1 * 3

а

л

н

л

ХО

Л

а

о

С

Candida род

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

Причины ошибок при микроскопических исследованиях

Причинами получения недостоверных результатов при микроскопической идентификации дрожжевых грибов могут являться:

  • нарушение алгоритма действий на преаналитическом этапе исследования;
  • отсутствие характерных структур грибов в доступных полях зрения;
  • ложноположительные результаты при регистрации артефактов в микроскопическом препарате.

Ложноположительные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:

а)            на преаналитическом этапе исследования:

  • ·         плохая обработка многоразовых пробирок, флаконов для сбора материала, в которых могут оставаться элементы грибковых клеток;
  • ·         использование для приготовления мазка загрязненных грибковым материалом бактериологических петель, пипеток, стекол;
  • ·         попадание в образец волокон шерсти, хлопка, фильтровальной бумаги (при нарушении правил забора материала или его транспортировки) - обычно они встречаются как единичные находки, чаще всего в одном поле зрения.

б)            на аналитическом этапе исследования:

  • ·         применение предметных стекол с царапинами и другими дефектами, в результате чего появляются артефакты, которые ошибочно могут быть приняты за мицелий или псевдомицелий гриба;
  • ·         использование плохо профильтрованного или длительно хранившегося раствора красителя, содержащего кристаллы;
  • ·         наличие контаминанта в иммерсионном масле, если иммерсионные линзы не были очищены после просмотра препаратов, содержащих грибы, или иммерсионное масло загрязнено грибами, если пипетка, которой оно наносится на мазок, случайно соприкасалась с положительным мазком;
  • ·         недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к сохранению окраски на некоторых структурах;
  • ·         попадание волокон хлопка или фильтровальной бумаги, имитирующих фрагменты гифов, при неправильном просушивании предметного стекла с образцом.

Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:

а) на преаналитическом этапе исследования:

  • плохое качество или недостаточное количество исследуемого материала;
  • неудачный выбор частиц патологического материала для приготовления мазка;
  • нарушение условий хранения, транспортировки, консервации материала.

б) на аналитическом этапе исследования:

  • приготовление слишком тонкого или толстого мазка, плохая фиксация мазка (над пламенем горелки) или несоблюдение режимов окрашивания (неправильная экспозиция при окраске);
  • нарушение методики просмотра мазка (малое число просмотренных полей зрения);
  • плохое качество красителей и реагентов.

В случае повторного исследования при просмотре мазков ложноотрицательный результат может быть обусловлен следующими ошибками:

  • после первичного просмотра с препарата не было удалено иммерсионное масло (при длительном воздействии оно обесцвечивает окраску) или препарат тщательно протирали при удалении иммерсионного масла, что вызвало повреждение мазка;
  • окрашенные мазки хранились в месте, доступном прямым солнечным лучам или ультрафиолетовому свету, парам кислот. Мазки, окрашенные флуорохромами, при длительном хранении могут утрачивать флуоресценцию.

Структуры, имитирующие патогенные грибы

Имитаторы грибов в препаратах кожи и ее придатков (волосы, ногти), слизистых оболочек:

  • ·         волокна текстиля - лежат отдельно от клеток биологического материала, крупнее, чем гифы грибов, неравномерной толщины, не септи- рованы;
  • ·         кристаллы щелочи - имеют вид тонких волокон с двойной стенкой, но, в отличие от мицелия грибов, не имеют общей оболочки для всех элементов нити, не ветвятся, имеют стекловидную прозрачность, моно- морфны. Добавление под покровное стекло капли дистиллированной воды приводит к растворению кристаллов;
  • ·         жировые капли - имитируют дрожжевые клетки, часто встречаются в плохо просветленном материале;
  • ·         зерна кератогиалина - могут быть приняты за споры грибов, однако они мельче по размерам и расположены внутри клеток кожи, что устанавливается при вращении микровинта микроскопа;
  • ·         мозаичный гриб - артефакт, образующийся при кристаллизации КОН при чрезмерном нагревании препаратов. В нем нет четкого деления на клетки. Представлен в виде гомогенных светлых элементов, различных по форме и размерам, имеющих сетчатое деление. При подогревании препарата или его хранении в течении 1-3 дней мозаичный гриб исчезает;
  • ·         пузырьки воздуха в препарате.

Имитаторы патогенных грибов в срезах ткани:

а)     имитаторы нитчатой структуры:

  • ·         нити фибрина (при окраске по Граму - Вейгерту);
  • ·         вытянутые и уплощенные волокнистые фиброциты;
  • ·         нити полисахаридов стенок капилляров (при PAS-методе окраски);
  • ·         базальные мембраны, щеточная кайма эпителия (при PAS-методе окраски);
  • ·         коллагеновые и эластические волокна (при импрегнации серебром по Гомори - Грокотту);
  • ·         ретикулярные волокна;
  • ·         вытянутые и уплощенные волокнистые фиброциты;
  • ·         тонкие обызвествленные волокна интерстиция, имитирующие коккоподобный мелкозернистый мицелий нокардий.

б)     округлые и сферические внутри- и внеклеточные имитаторы грибов: русселевские тельца, амилоидные тельца;

  • ·         обесцвеченные, вспученные и видоизмененные эритроциты;
  • ·         зерна гемосидерина при импрегнации серебром;
  • ·         микроглобулярные преципитаты рибонуклеиновой кислоты;
  • ·         скопления муцинозных веществ в эпителиальных клетках, макрофагах, иногда располагающиеся внеклеточно, выявляемые при окраске на мукополисахариды;
  • ·         выпадающие осадки красителей;
  • ·         жировые капли;
  • ·         округлые образования, обнаруживающиеся при гранулематозных образованиях и в гигантских клетках.

Интерпретация полученного результата микроскопического исследования

Основным недостатком всех микроскопических методик и причиной низкой чувствительности метода является невозможность стандартизации.

Часто встречающиеся в бланках лабораторного исследования формулировки “найдены споры дрожжевых грибов” или “найден септированный мицелий” не обеспечивают клиницисту безусловных доказательств наличия микоза, особенно в случае нестерильных локусов (кожа, слизистые оболочки). В этой ситуации диагноз микоза может быть поставлен только при анализе всех данных: клинической картины, анамнестических указаний, полного описания микроскопической картины.

Распространенное в последнее время мнение, что нахождение в микроскопическом препарате септированного мицелия свидетельствует в пользу инвазии микоза и хронизации процесса, не имеет под собой оснований. В качестве аргумента часто ссылаются на известную цитату из фундаментальной работы О.К. Хмельницкого и Н.М. Хмельницкой “Патоморфология микозов человека” (ИД СПбМАПO, 2005): “При самых поверхностных кандидозных поражениях кожи имеет место активное проникновение возбудителя в ткани хозяина. При кандидозе кожи грибы рода Candida могут обнаруживаться в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба мало; представлены в виде нитей сеп- тированного ветвящегося мицелия или овоидными спорами. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба”, забывая, что в цитируемом фрагменте речь идет о патоморфологическом материале - срезе ткани, но не о соскобах. Кроме того, сам О.К. Хмельницкий никогда не считал наличие мицелия абсолютным и безусловным признаком инвазии:. считают, что инвазивный рост Candida осуществляется нитями псевдомицелия, который трансформируется из дрожжеподобной формы гриба. Тем не менее в очагах поражения выявляются обе фазы гриба”. Таким образом, обнаружение вегетирующих форм (почкующихся клеток, псевдогиф и гиф) не является критерием положительной микроскопической диагностики, не свидетельствует об активности инфекции, а характеризует ухудшение условий роста.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.