text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Методы диагностики микозов

  • 15 декабря 2011
  • 74

Культуральное исследование

Культуральное исследование является значительно более чувствительной методикой, чем микроскопия. Выделение чистой культуры гриба применяется для идентификации рода и вида гриба, для подтверждения диагноза микотического процесса при отрицательных данных микроскопии. Оптимальные значения рН среды для культивирования большинства видов грибов находятся в диапазоне 5,8-6,5. Для получения чистой культуры и устранения контаминации сопутствующей бактериальной флорой используют различные селективные добавки к средам. С этой целью наиболее часто применяются различные антимикробные вещества и антибиотики.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

При культуральном исследовании мазок и посев производятся обязательно из одной и той же порции материала. Это основное требование правильного микробиологического исследования.

Выбор алгоритма культурального исследования

Основной средой для получения чистой культуры дрожжевых грибов в медицинской микологии является среда Сабуро. В нее вводятся различные селективные добавки в зависимости от типа исследуемого образца.

Для исследования мазков со слизистых носо- и ротоглотки, урогенитального тракта, при исследовании кала на дисбактериоз используют среду Сабуро с хлорамфениколом, среду Сабуро с гентамицином; реже используют среду, содержащую комбинацию обоих антибиотиков. При культуральном исследовании материалов кожи и ее придатков в качестве добавки в среду Сабуро вводят актидион (циклогексимид), который обеспечивает селективный рост дерматофитов.

При симптоматике иммунодефицитных состояний и подозрении на поражение ЦНС образцы спинномозговой жидкости и сыворотки или плазмы крови высевают в гемфлакон и одновременно проводят их исследование на наличие растворимого ксиломаннанового антигена методом латексной агглютинации или иммуноферментного анализа. При получении положительного результата в качестве подтверждающего метода осуществляют пересев обогащенной культуры из гемфлакона на специализированные агаризованные среды для выявления криптококка (среда L-DOPA). Оценивают оксидазную активность полученных колоний.

Идентификация выделенных культур грибов

В лабораторно-диагностической практике используются культуральноморфологические критерии идентификации: вначале оцениваются макроморфологические характеристики роста культуры гриба на агаровых средах, а затем микр омор фология гриба. В з атруднительных случаях пр ов одят изучение ферментативной активности культуры гриба (табл.1). Основными возбудителями заболеваний являются C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata и C. crusei. Значительно реже выявляются C. lusitaniae, C. guiller mondii, C. rugosae и др.

C. albicans на среде Сабуро имеет вид блестящих кремово-белых колоний. При микроскопии колония состоит из округлых, овальных почкующихся клеток 3010 мкм в диаметре. По периферии колоний могут встречаться нити псевдомицелия. На обедненных средах C. albicans формирует толстостенные хламидоспоры.

Таблица 1

Биохимические характеристики наиболее часто встречающихся видов Candida

Образование

ростковых

трубок

Образование хламидоспор на рисовом агаре

Ферментация

Ассимиляция

Вид

Candida

Глюкоза

Мальтоза

Сахароза

Лактоза

Галактоза

Глюкоза

Мальтоза

Сахароза

Лактоза

Галактоза

Этанол

Тип роста

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

C. albicans

+

+

+

+

-

-

+

+

+

+

-

+

-

К ы>лов дный

и шаровидный

C. parapsilosis

+

+

+

+

+

+

В виде “елки”, появление бластоконидий запаздывает

C. tropicalis

+

+

+

+

+

+

+

+

±

Ша ов дный, крыловидный, цепочечный и в виде “елки”

C.glabrata

-

Шаровидный,

крыловидный

C. crusei

+

+

+

Шаровидный, крыловидный, в виде “елки”

C.kefir

-

-

+

-

+

+

+

+

-

+

+

+

+

Цепочечный

C. guiller- mondii

-

-

+

-

+

-

+

+

+

+

-

+

+

Древов дный

Серологическая диагностика микотических инфекций

Серологическая диагностика важна тем, что позволяет определить высокие титры антител или циркулирующие антигены у пациентов с иммунодепрессией, которые относятся к одной из групп риска по развитию системных микозов. Классическая микробиологическая диагностика системных микозов, вызванных Candida, подтверждается повторным выделением грибов из биологических образцов, которые в норме стерильны (кровь, моча и т. д.). Однако интерпретировать результаты, получаемые при выращивании культур грибов, трудно, т. к. грибы часто выделяются в виде единичных колоний, и даже при распространенной инфекции результат анализа гемокультуры может быть отрицательным.

Обнаружение маннанового антигена, циркулирующего в сыворотке крови, позволяет усовершенствовать диагностику кандидозной инфекции, особенно у иммуносупрессивных пациентов.

Диагностика инвазивного кандидоза должна быть основана на сочетании выявления как антител к маннану, так и самого циркулирующего в крови маннанового антигена. Сочетание этих двух тестов позволяет поставить ранний лабораторный диагноз, повысить в целом чувствительность методов лабораторной диагностики. В целом сочетание клинических и лабораторных результатов позволяет снизить ятрогенные факторы риска. Комбинация этих двух тестов может стать важной составляющей системы клинико-лабораторного мониторинга в ходе лечения.

Образцы сыворотки с концентрацией маннанового антигена меньше чем 0,25 нг/мл можно рассматривать как отрицательные. Образцы сыворотки с концентрацией маннанового антигена 0,25-0,50 нг/мл необходимо рассматривать как неопределенные по содержанию маннанового антигена. Образцы сывороток с концентрацией маннана 0,50 нг/мл или более нужно рассматривать как содержащие маннановый антиген. При постановке окончательного диагноза инвазивного кандидоза и перед началом этиологической терапии положительные результаты необходимо интерпретировать в контексте с клинической картиной, результатами рентгенологических и лабораторных исследований. Исследование на антигенемию должно проводиться регулярно. Интервал между исследованиями зависит от оценки факторов риска возникновения системного микоза, но не реже 1 раза в 2 недели.

Сыворотки с концентрацией антиманнановых антител меньше 5 УЕ/мл рассматриваются как не содержащие антиманнановых антител. Сыворотки с концентрацией антиманнановых антител в диапазоне 5-10 УЕ/мл рассматриваются как сомнительные на предмет наличия антиманнановых антител. Сыворотки с концентрацией антиманнановых антител больше 10 УЕ/мл рассматриваются как содержащие антиманнановые антитела.

Определение уровня антиманнановых антител в сыворотке является важным элементом определения иммунного статуса пациента по отношению к грибам рода Candida. Наличие антиманнановых антител свидетельствует о наличии в организме хозяина дрожжей, принадлежащих к роду Candida, и должно интерпретироваться как дополнительный фактор риска инвазивного кандидоза у пациентов из группы риска. Внезапное изменение уровня антител может свидетельствовать о прогрессировании активной инфекции: эта находка должна интерпретироваться в контексте клинической картины у пациента. Для диагностики инвазивного кандидоза мониторинг уровня антител должен сочетаться с определением уровня циркулирующего маннанового антигена.

Регулярный серологический мониторинг более информативен, чем однократное тестирование, и повышает выживаемость пациентов группы высокого риска.

При мониторинге лечения снижение уровня галактоманнана у пациентов на 4-5-й день от начала терапии является показателем положительного ответа на назначенное лечение. Сохранение концентрации галактоманнана на фоне проводимой терапии может говорить о ее неэффективности, за исключением случаев нарушения фильтрационной функции почек. Повышение уровня галактоманнана указывает на необходимость коррекции или возобновления терапии.

Корректная терапия, назначенная после выявления в сыворотке крови галактоманнанового антигена, позволяет снизить летальность с 56-88 до 5-24% при уменьшении количества курсов эмпирической терапии в 2-5 раз.

Определение антифунгиальной чувствительности

В настоящее время разработан целый ряд объективных методик для определения in vitro антифунгиальной чувствительности широкого спектра дрожжевых и плесневых грибов. В настоящее время был сделан целый ряд шагов по увеличению стандартизации и улучшению клинической интерпретации данных методов. Это нашло отражение в стандартах CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute - Институт клинических и лабораторных стандартов, до 2005 г. - National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS), описывающих референтные методы для определения чувствительности дрожжевых и плесневых грибов  и в публикациях по клинической интерпретации критериев чувствительности (преимущественно грибов рода Candida по отношению к флюконазолу).

В мировой практике CLSI постоянно развивает референсную методологию определения антифунгиальной чувствительности, используя многочисленные воспроизводимые исследования, а также сопоставления существующих лабораторных стандартов на регулярной основе. Разработка и практическое внедрение новых методов определения антифунгиальной чувствительности осуществляется с использованием контрольных штаммов грибов при сопоставлении с результатами референсных методов CLSI.

Стандарт NCCLS М 27 А 2.

Референтный метод для определения антифунгиальной чувствительности дрожжевых грибов методом последовательных разведений в жидкой среде

Стандарт NCCLS М27 А2 распространяется на исследования дрожжевых грибов, включая грибы рода Candida, Cryptococcus (C. neofor- mans и C. attii) с использованием макро- или микропоследовательных разведений в жидкой среде. В качестве среды рекомендовано использовать RPMI-1640 (сложная многокомпонентная среда с добавками 0,2% глюкозы, РН 7,0). Инокулят стандартизуется по мутности (0,5 МакФарланда). Инкубация осуществляется при 35 0С в течение 24 ч для грибов рода Candida или 48-72 ч для требовательных грибов, таких как Cryptococcus. Метод микроразведений осуществляется в лунках стандартного 96-луночного микропланшета, при этом сопоставляется рост грибов в лунках с различной концентрацией препарата и контрольной лункой. Ингибирование оценивается в баллах от 0 до 4 по следующей шкале: 0 - содержимое лунки оптически прозрачно; 1 - легкая “дымка”; 2 - существенное снижение мутности суспензии по сравнению с лункой, не содержащей антифунгиального препарата; 3 - слабое снижение мутности по сравнению с лункой, не содержащей антифунгиального препарата; 4 - мутность совпадает с мутностью в лунке, не содержащей антифунгиального препарата. Минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) для амфотерицина В считается наименьшая концентрация, при которой результат оценивается как 0 (содержимое лунки оптически прозрачно). МИК для азольных препаратов и 5-флюороцитозина является минимальная концентрация, при которой результат оценивается как 2 (существенное снижение мутности) (табл. 5).

Профиль антифунгиальной чувствительности

Основные практические трудности при определении чувствительности грибов к антифунгиальным препаратам обычно связаны со стандартизацией приготовления инокулята и определением конечной концентрации. Проверка плотности и стерильности инокулята должна осуществляться при каждом исследовании, т. е. параллельно с тестированием на чашку Петри, содержащую агаризованную среду Сабуро с декстрозой, высевается стандартный объем готового инокулята. Через 24 ч инкубации подсчитывается количество колоний. Если их слишком мало или слишком много, рекомендуется повторить тест.

В настоящее время существуют модификации метода определения МИК, в которых на стадии регистрации результатов применяются цветовые индикаторы, или регистрация автоматизирована с использованием микропланшетного ридера или автоматического анализатора зон ингибирования роста, что позволяет избежать субъективных ошибок при получении количественных данных. С целью увеличения клинической эффективности исследования часто полученный результат антифунгиальной чувствительности подтверждают другим методом, особенно в тех случаях, когда имеются сомнения в достоверности полученного результата.

Таблица 5

Профиль антифунгиальной чувствительности для патогенных для человека грибов

Вид

Амф. В,

Флю,

Вори,

Итра,

Кето,

Тербин,

5-флю,

Каспо

гриба

мг/мл

мг/мл

мг/мл

мг/мл

мг/мл

мг/мл

мг/мл

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Candida

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

В

Ч

Ч

albicans

0,5

0,5-1

0,06

0,25

0,25

0,03-

>128

1,0

Candida

Ч

ЧДЗ

Ч

Ч

Ч

Нет

Ч

Ч

famata

0,5

4-8

0,06

0,25

0,25

данных

1,0

Candida

Ч

ЧДЗ

Ч

ЧДЗ

В

У

Ч

Ч

glabrata

0,5

2-32

1-2

0,5-1

1-4

>128

0,5

Candida

Ч

ЧДЗ

Ч

Ч

Ч

В

Ч

Ч

guillier-

mondii

0,5

4-8

0,25

0,5

0,5

0,5-1

6,25-100

0,125

0,2

Candida

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

У

В

Ч

kefyr

0,5

0,5-1

0,03

0,25

0,5

0,25

0,5-50

0,03

16

Candida

Ч

У

Ч

ЧДЗ

I

У

В

Ч

krusei

0,5-1

32-64

0,5-1

0,5

1,0

50->100

8-32

Candida

В

Ч

Ч

Ч

Ч

Нет

Ч

Ч

lusitaniae

0,5-2

0,5-1

0,06

0,25

0,25

данных

0,125

Candida

parapsilosis

Ч

0,5-1

Ч

1-2

Ч

0,06

Ч

0,125

0,5

Ч

0,5

Ч

0,25-2

Ч

1,0

Ч

Candida

Ч

ЧДЗ

Ч

Ч

В

В

Ч

Ч

tropicalis

0,5

1-8

0,25

0,25

0,5-1

10-128

1,0

Cryptococ-

Ч

ЧДЗ

Ч

ЧДЗ

Ч

Ч

Ч

У

cus neo- formans

0,5-1

2-8

0,25

0,5

0,25

0,25

2-8

Malassezia

furfur

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч*

Ч

Нет

данных

Saccharo-

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Нет

Ч

Нет

myces cer- evisiae

0,5

2-8

0,03

0,5-1

0,5

данных

0,125

данных

Trichospo-

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

В

I

Нет

ron beigel- lii

1,0

2-8

0,125

0,125

0,5

0,05-128

8-16

данных

Примечания: Амф. В

- амфотерицин В; Флю

- флюконазол; Вори - вориконазол

Итра - итраконазол; Кето - кетоконазол; Тербин - терб

инафин (только для топиче-

ской формы): 5-флю

5-флюцитозин; Каспо -

каспофунгин; Ч -

чувствительный;

ЧДЗ - чувствительный или дозозависимый; У - устойчивый; В П - промежуточный.

- вариабельный

Стандарт NCCLS M44-P

Определение антифунгиальной чувствительности дрожжевых грибов с помощью дискодиффузионного метода

Стандарт М44 Р описывает вновь утвержденную методологию для исследования чувствительности грибов рода Candida дискодиффузионным методом. Критерии для родов дрожжевых грибов и для плесневых грибов с использованием этого метода в настоящее время находятся в состоянии разработки. Документ включает в себя значения диаметров зон ингибирования роста для флюконазола и рекомендации по процедуре контроля качества для флюконазола и вориконазола. В качестве твердой среды для постановки дискодиффузионного метода документ рекомендует использовать агаризованную среду Мюллера - Хинтона, обогащенную 0,2% глюкозы и содержащую краситель метиленовый синий в концентрации 0,5 мкг/мл. Среда Мюллера - Хинтона отличается высокой степенью стандартизации своего состава и, как следствие, высокой воспроизводимостью результатов. Добавка глюкозы обеспечивает условия роста большинства дрожжевых грибов, наличие метиленового синего в составе среды контрастирует границу зоны ингибирования роста. Готовая среда разливается в чашки Петри, рН готовой среды - 7,2-7,4. Посев осуществляется методом сплошного газона, плотность инокулята стандартизована по мутности - 0,5 Мак-Фарлана. На поверхность среды апплицируются бумажные диски стандартного диаметра, содержащие антифунгеальные препараты (флюконазол 25 мкг или вориконазол 1 мкг). Чашка с культурой инкубируется в течение 24 ч при 35 °С. Если по истечении 24 ч наблюдается скудный рост культуры, необходимо продолжить инкубацию в течение дополнительных 24 ч. В течение инкубации происходит диффузия антифунгиального препарата от диска в толщу среды с образованием концентрационного градиента. Критерием определения чувствительности служит диаметр зоны ингибирования роста и соответствующая минимальная ингибирующая концентрация, которые были установлены для грибов рода Candida по отношению к флюконазолу.

Метод является простым и недорогим средством для проведения скрининговых исследований. Однако рекомендуется все культуры, зарегистрированные как устойчивые, дополнительно исследовать методом последовательных разведений М27 А2 в качестве подтверждающего. В перспективе дискодиффузионный метод может быть адаптирован для исследования других грибов, включая плесневые, но получаемые результаты нуждаются в стандартизации с точки зрения интерпретации с использованием рефе- ренсных методов NCCLS.

Следует отметить, что современная стадия развития лабораторных методов определения антифунгиальной чувствительности позволяет лаборатории осуществлять эти исследования в рутинной практике. Однако остаются не разрешенными несколько вопросов, не говоря о том, что для определения чувствительности необходима культура, получить которую не всегда возможно. Видовая идентификация часто дает возможность предсказать чувствительность этого вида in vitro, поэтому вопрос о том, какие клинические образцы должны быть исследованы, остается открытым. Надо ли исследовать только образцы, в которых грибы являются клинически значимыми, или осуществлять лабораторный скрининг всех изолятов? Ответ на этот вопрос может быть получен для каждого отдельного ЛПУ с учетом анализа накопленных данных о превалирующих возбудителях, их видовом составе и антифунгиальной чувствительности при участии специалистов по химиотерапии, клинических микробиологов и клиницистов.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.