Молекулярно-генетические технологии, основанные на полимеразной цепной реакции, в диагностике перинатальных инфекций

25

В настоящее время инфекционная патология плода и новорожденного занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности в неонатальный период.

Гнойно-септические осложнения у новорожденных могут проявляться в виде внутриутробного инфицирования с последующей реализацией болезни в ранний неонатальный период или бактериальной инфекции, развившейся в более поздние периоды жизни, что обусловлено как снижением защитных сил новорожденного ребенка, так и повышением вирулентности штаммов микроорганизмов в учреждениях родовспоможения, отделениях интенсивной терапии вследствие активного использования инвазивных лечебных процедур (искусственная вентиляция легких, катетеризация сосудов), антибиотиков широкого спектра действия.

К группе особого риска по развитию заболеваний в неонатальном периоде, неонатальной смертности относятся недоношенные дети, причем среди недоношенных детей доля инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу, в 15-20 раз выше, чем среди доношенных. Вероятность возникновения заболевания увеличивается с уменьшением срока гестации. Особенно высокий риск развития септического процесса отмечается в группе детей с экстремально низкой массой тела при рождении.

В последние годы присутствует тенденция к увеличению частоты возникновения смешанных вирусно-вирусных и вирусно-бактериальных инфекций. Особую опасность для жизни и здоровья этого контингента пациентов представляют септические осложнения, менингит и респираторные инфекции, которые могут приводить к развитию опасных для жизни осложнений.

Этиологическая структура сепсиса новорожденных неоднородна. Имеются существенные различия в этиологии в зависимости как от возраста детей, так и экономического уровня развития стран, в которых они проживают.

Тем не менее ключевыми патогенами, провоцирующими заболевания, являются Escherichia coli, Klebsiella sp.,

Staphylococcus aureus и коагулаза-негативные стафилококки, стрептококки, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa и Haemophilus influenzae.

Неонатальные инфекции, возникающие в первые 3 дня жизни, в 40% случаев обусловлены стрептококками группы В, инфицирование происходит во время родов. Для ранней формы заболевания свойственны молниеносное течение и высокая летальность.

Методы диагностики инфекционных заболеваний у новорожденных

Принимая во внимание скорость развития и тяжесть течения инфекционного процесса у новорожденного ребенка, трудно переоценить значимость возможности использования в неонатальной практике методов экспресс-диагностики. Ранняя и эффективная диагностика перинатальных инфекций позволяет проводить своевременную и патогенетически обоснованную терапию у этой группы пациентов. В существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных большое значение придается серодиагностике, прежде всего для выявления антител к возбудителям вирусных инфекций.

Основными методами, предназначенными для обнаружения большинства микроорганизмов, остаются бактериологические методы, включающие высев и получение чистой культуры микроорганизмов с последующим применением методов биохимического и иммунологического анализа для определения их таксономической принадлежности. Однако стандартные микробиологические методы трудоемки и для получения результатов требуется не менее 36 ч.

Кроме того, чувствительность микробиологического метода в лучшем случае не превышает 87%. К тому же эффективность культивирования некоторых микроорганизмов (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) может в значительной степени зависеть от условий забора клинического материала, транспортировки и культивирования.

В настоящее время для культивирования крови в микробиологических лабораториях применяют автоматизированные приборы, например системы BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), BacT/Alert (Biome'rieux, Durham, NC) или ESP (Trek Diagnostic Systems, Inc, Westlake, OH). Для обнаружения бактерий при помощи культурального метода требуется приблизительно от 12 до 24 ч инкубации для грамотрицательных бактерий и от 24 до 48 ч - для грам- положительных микроорганизмов, с дополнительным временем, необходимым для изоляции микроорганизмов, содержащихся в культуре крови, их идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам.

ПЦР-диагностика вирусных инфекций

Наиболее быстро развивающимся направлением в области клинической лабораторной диагностики стало создание и совершенствование методов молекулярной диагностики инфекционных болезней, основанных на обнаружении и анализе специфических нуклеотидных последовательностей возбудителей.

Наиболее чувствительны и специфичны методы, основанные на эффектах молекулярной гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего речь идет о методах, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР).

На сегодняшний день не существует ни одного стандартизованного, оцененного путем проведения широких клинических испытаний набора реагентов, пригодного для обнаружения нуклеиновых кислот патогенных бактерий в образцах крови новорожденных. Набор реагентов для ПЦР- диагностики патогенных бактерий в крови больных с подозрением на развитие сепсиса создан фирмой Roche (LightCycler SeptiFast system). Этот набор стандартизирован и позволяет обнаруживать 25 видов патогенных бактерий и грибов в образцах крови. Однако оценка возможности его использования для подтверждения сепсиса у новорожденных не проводилась и, кроме того, требуемый объем крови для тестирования составляет 3 мл.

В неонатальной практике методы, основанные на ПЦР, прежде всего используются для диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами.

Традиционные методы обнаружения вирусов в клиническом материале имеют несколько недостатков по сравнению с молекулярными методами, включая основанные на технике ПЦР. Вирусологические методы диагностики цитомегаловирусной инфекции считаются “золотым стандартом” диагностики, т. к. классический вариант этого метода позволяет изолировать вирус из клинических материалов. Недостатками культурального метода являются продолжительное время, необходимое для проявления цитопатического действия вирусов, а также способность этого метода эффективно обнаруживать только ограниченное число таксономических групп вирусов.

Кроме того, на эффективность метода в значительной степени влияют качество клинического образца, условия транспортировки и хранения проб, а также тип используемых клеток. Получаемые результаты не в состоянии помочь в выборе стратегии лечения.

Результаты анализов, получаемые при помощи еще одного часто используемого метода диагностики вирусных инфекций - метода ПЦР с флуоресцентной детекцией, доступны в более короткие сроки, что улучшает качество терапевтической помощи, в частности благодаря тому, что уменьшается необходимость применения антибиотиков и укорачиваются сроки пребывания пациентов в стационаре. Однако этот метод отличается меньшей чувствительностью по сравнению с культуральным при выявлении некоторых групп вирусов.

Применение ПЦР показало более высокую чувствительность и скорость в сравнении с традиционными методами. В настоящее время ПЦР уже считается “золотым стандартом” диагностики у новорожденных менингита, вызываемого вирусом простого герпеса. Продолжается интенсивная разработка и внедрение в практику ПЦР-исследований для выявления цитомегаловирусов, парвовирусов, энтеровирусов, вирусов ветряной оспы/ опоясывающего лишая, краснухи и гепатита B.

Бесспорным достоинством метода ПЦР является его способность обнаруживать в клиническом материале несколько типов вирусов одновременно, а также определять микроорганизмы, которые не могут быть обнаружены бактериологическими методами или для которых пока не существует доступных наборов (например, коронавирус, метапневмовирус, Chlamydia pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae).

ПЦР-диагностика неонатального сепсиса

К инфекционным состояниям, ведущая роль в возникновении которых принадлежит бактериальным патогенам и нуждающихся в улучшении методологии лабораторной диагностики, прежде всего относится неонатальный сепсис.

В настоящее время не существует лабораторного теста, который имел бы решающее значение для диагностики неонатального сепсиса.

Показано, что даже культуральные методы имеют низкий уровень чувствительности. Причинами этого могут быть низкая численность бактерий в кровеносном русле ребенка, малые объемы крови, а также антибиотикотерапия беременных, имеющих высокий риск развития преждевременных родов, а также непосредственно во время родов рожениц, колонизированных, например, Streptococcus agalactiae. Хорошо известно, что малый объем крови, который может быть получен от новорожденного ребенка для бактериологического исследования, уменьшает шансы обнаружения микроорганизмов. Хотя новорожденные, как правило, имеют несколько большую величину бактериемии - от 10 до 300 КОЕ/мл, в то время как у взрослых людей этот показатель составляет 1-30 КОЕ/мл крови, количество крови, отбираемое для бактериологического исследования у новорожденных, значительно меньше, чем у взрослых: менее 1 мл по сравнению с 10-30 мл соответственно. С другой стороны, Kellogg J.A. et al. (2000) обнаружили, что у детей низкий уровень бактериемии (менее 10 КОЕ/мл) может быть обнаружен с гораздо большей частотой (вплоть до 68%), чем считали ранее. Было сделано заключение, что для обнаружения низких концентраций патогенных бактерий в крови необходимо собирать вплоть до 4,5% от объема крови пациента (приблизительно 4 мл/кг). Однако, т. к. новорожденные очень чувствительны даже к небольшой потере крови, у пациентов этой группы невозможно отобрать более чем 1-2 мл.

Jordan J.A. et al. провели одно из первых масштабных исследований по выявлению сепсиса у новорожденных с использованием ПЦР. В этом исследовании в общей сложности изучались 548 парных образцов крови, полученных от новорожденных детей, поступивших в отделение интенсивной терапии с подозрением на сепсис. Пробы были проанализированы при помощи бактериологического метода с использованием аппарата BACTEC 9240 и метода ПЦР с амплификацией гена бактериальной 16S рРНК, с предварительным 5-часовым культивированием 200 мкл образцов крови в 4 мл жидкой питательной среды TSB (tryptic soy broth), с целью обогащения образцов крови бактериями. Положительные результаты при культивировании крови и ПЦР-исследовании были получены в 25 (4,6%) и 27 (4,9%) случаях соответственно. Сравнительный анализ результатов исследования показал, что чувствительность, специфичность, а также положительное и отрицательное предсказывающие значения для метода ПЦР составили 96,0%, 99,4, 88,9 и 99,8% соответственно.

В 2009 г. были опубликованы результаты еще одного сравнительного исследования, направленного на выяснение эффективности использования классической ПЦР для диагностики сепсиса у новорожденных. В это исследование вошли 48 новорожденных детей с подозреваемым сепсисом. У 31 пациента на основании комплекса клинических и лабораторных показателей был диагностирован сепсис. При этом только у 6 из них удалось подтвердить поставленный диагноз посредством культурального метода.

При помощи ПЦР-анализа было выявлено 10 положительных проб. В двух случаях метод ПЦР не дал положительных результатов, в то время как культуральный метод дал позитивный результат, и в одном случае метод ПЦР дал ложноположительный ответ.

В этом исследовании параметры эффективности диагностики бактериального сепсиса у новорожденных, проведенной путем ПЦР, в сравнении с результатами культурального метода составили: чувствительность - 66,7%, специфичность - 87,5%, положительное и отрицательное предсказывающие значения - 95,4 и 75,0% соответственно. Несмотря на то что неонатальный сепсис был диагностирован у 31 из 48 пациентов, входивших в это исследование, патогенные бактерии были обнаружены при бактериологическом методе только у 6 из них (19,4%). Учитывая, что количество пациентов в этом исследовании было относительно низким, различия не были статистически достоверными. В комбинации эти два метода показали чувствительность 35,5%. Шесть пациентов, имевших позитивные результаты при проведении ПЦР- исследования, имели отрицательные результаты при бактериологическом исследовании. У пяти из этих шести пациентов сепсис был диагностирован на основании иных клинико-морфологических признаков, что позволяет считать эти результаты истинными, а не следствием экзогенной контаминации образцов крови бактериями. По мнению авторов, отрицательный результат, полученный при бактериологическом исследовании, возможно, был связан с недостаточным объемом крови, взятой у пациентов. Кроме того, предварительные исследования использующегося в этой работе набора реагентов для ПЦР показали, что предел обнаружения микроорганизмов составлял 103 - 104 КОЕ/мл образцов крови, таким образом, не позволял детектировать выраженно низкий уровень бактериемии. Более низкие значения, характеризующие эффективность диагностики септических состояний путем проведения ПЦР в сравнении с культуральным методом, полученные в этом исследовании, связаны с тем, что авторами был исключен этап предварительного обогащения образцов крови путем ее преинкубации в питательной среде, как было предложено в ранее обсуждавшемся исследовании.

Jordan J.A. et al. (2005) были разработаны диагностические наборы, основанные на использовании ПЦР в режиме реального времени c гибри- дизационными TaqMan-зондами для обнаружения ДНК бактерий. ДНК была выделена из проб цельной крови с использованием концентрирующих колонок Qiagen без предварительной инкубации в питательной среде. Испытания показали, что предел чувствительности созданных диагностических наборов составлял 40, 50 и 2000 колониеобразующих единиц бактерий на 1 мл крови (КОЕ/мл) для таких часто ассоциированных с сепсисом новорожденных патогенных бактерий, как кишечные палочки, стрептококки группы В и Listeria monocytogenes, соответственно, при условии числа лейкоцитов крови ниже 39 000 в 1 мкл образца. Проведение исследований с использованием этого набора требовало не более 4 ч для обоих этапов, включавших подготовку образцов и проведение реакции ПЦР. Также было показано полное соответствие между результатами, полученными с помощью культурального метода и методом ПЦР в режиме реального времени, составившее в этом исследовании 94,1%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование ПЦР позволяет увеличить эффективность проводимой терапии у новорожденных с подозрением на неонатальный сепсис.

Однако необходимо отметить, что технология ПЦР в режиме реального времени не исключает необходимость проведения бактериологического исследования крови, т. к. чистые культуры изолированных бактерий все еще необходимы для определения их чувствительности к антимикробным препаратам.

С другой стороны, объединение метода ПЦР в режиме реального времени, основанного на выявлении в образах крови консервативной области гена, кодирующего 16S рРНК бактерий, с методом быстрого определения и анализа последовательности нуклеотидов, накапливающихся при амплификации, например методом пиросеквениерования, позволит менее чем за 8 ч обеспечить врача необходимой информацией.

Проблемы при использовании методов ПЦР

Результаты проведенных к настоящему времени исследований также позволили выявить и основные проблемы, возникающие при использовании метода ПЦР для диагностики неонатальных септических состояний. Важнейшим условием достижения адекватной чувствительности молекулярных методов является эффективный лизис бактериальных клеток для высвобождения ДНК. По причине специфического строения клеточной стенки у грамположительных бактерий их лизис осуществляется намного труднее, чем у грамотрицательных бактерий.

Возможно включение в протокол пробоподготовки дополнительных этапов ферментативной обработки с использованием, например, недавно предложенных и отличающихся более широким спектром литической активности, по сравнению со стандартно применяющимся лизоцимом, ферментов лабиазы или ахромопептидазы.

Кроме того, целесообразно также усовершенствовать и такие этапы стандартных протоколов пробоподготовки, как экстракция и концентрирование ДНК. Для этой цели ДНК из лизатов цельной крови может быть извлечена с использованием ручных методов, например при помощи специальных сорбирующих колонок, или существующих автоматизированных методов. Также необходимо учитывать, что нуклеиновые кислоты, выделенные из клинического материала, в частности из цельной крови, содержат не только возможную бактериальную ДНК, но также геномную лейкоцитарную ДНК. Человеческая ДНК обычно присутствует в исследуемой пробе в значительно более высокой концентрации, чем бактериальная ДНК, и эта разница создает конкурентное преимущество при связывании на экстрагирующих колонках. Как отмечено выше, в одном из ранее проведенных исследований было показано, что ДНК, содержащаяся в образцах цельной крови, собранной от новорожденных детей с увеличенным числом лейкоцитов крови (более 39 000 в 1 мкл), конкурировала с экзогенно добавленной бактериальной ДНК при связывании на колонках Qiagen, что приводило к ложноотрицательному результату в ПЦР-исследовании.

Таким образом, на сегодняшний день можно констатировать, что основные проблемы при создании наборов реагентов, основанных на использовании методов ПЦР-анализа, и широком внедрении этой технологии в практику клинической диагностики бактериальных септических состояний у новорожденных в основном определены и могут быть преодолены. Фактически предпринятые недавно попытки улучшения чувствительности молекулярных исследований, в частности использование улучшенных методов очистки ДНК и применение для тестирования образцов технологии ПЦР в режиме реального времени, дали обнадеживающие результаты. Однако, прежде чем рекомендовать данный подход для широкого внедрения, следует проверить его эффективность в значительно большем количестве исследований.

Внедрение методов диагностики, основанных на ПЦР, для обнаружения бактериальной контаминации различных областей организма ребенка не сопровождается такими сложностями, как это происходит в случае исследования крови или цереброспинальной жидкости.

Это связано с тем, что при инфекционных заболеваниях патологическая контаминация таких часто исследуемых источников патогенных бактерий, как слизистые оболочки ротовой полости и носоглотки, кожи, слухового канала, желудочного содержимого или трахеального секрета, получаемых в виде аспиратов, а также мочи или испражнений обычно достигает высоких значений. Кроме того, объемы клинического материала, получаемые из этих источников, при правильной методике его забора составляют достаточное количество для проведения ПЦР.

Paule S.M. и соавт. (2004) был разработан набор, основанный на технологии ПЦР в режиме реального времени, для обнаружения колонизации носовой полости новорожденных золотистыми стафилококками. Носи- тельство S. aureus в носовой полости считается источником поддержания и распространения инфекции в учреждениях здравоохранения. В этом исследовании мазки из полости носа были собраны от 299 новорожденных, находившихся в условиях стационара. Один мазок был использован для бактериологического, а другой - для ПЦР-исследования. Предварительная обработка образца для ПЦР-исследования включала лизис бактерий при помощи фермента ахромопептидазы. Анализ полученных результатов показал, что чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные значения прогностической ценности для культурального и ПЦР- метода составили 92% против 96%, 100% против 100%, 100% против 100% и 98% против 99% соответственно. Причем время, затраченное на определение S. aureus путем использования метода ПЦР в режиме реального времени, составило всего 2 ч, в то время как на проведение диагностики при помощи культурального метода потребовалось от 1 до 4 дней.

Таким образом, внедрение новых методов диагностики, основанных на молекулярных технологиях, уже привело к изменению способов выявления наследственных заболеваний человека и инфекционных заболеваний, прежде всего вызываемых вирусами. Также в течение последнего десятилетия неуклонно увеличивалось число диагностических тестов, применяющихся в клинической бактериологии. Однако, притом что применение методов выявления и идентификации наиболее важных патогенных микроорганизмов бактериальной и вирусной природы, основанных на использовании массива молекулярных технологий, становится сегодня обычным направлением в лабораторной практике, все-таки в ближайшем будущем классические микробиологические методы не будут полностью вытеснены. Это связано с несколькими причинами, основными из которых являются необходимость улучшения техники выделения и очистки нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб биологического материала, а также необходимость получения чистых культур бактерий для определения спектра их чувствительности к антибиотикам. С другой стороны, результаты проводимых в настоящее время исследований, посвященных преодолению этих проблем, позволяют надеяться, что методы молекулярной микробиологии в еще большей степени будут приближены к обычной клинической лаборатории.

Опыт разработки наборов для ПЦР-диагностики бактериальных инфекций

В нашей лаборатории разработана тест-система, обеспечивающая одновременную экспресс-диагностику инфекционных заболеваний, вызванных Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов и новорожденных детей, путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени.

В качестве генов-мишеней при разработке диагностической тестсистемы для детекции патогенов E. coli и S. agalactiae были избраны гены uidA и cfb соответственно. Ген uidA кодирует синтез фермента - глюкуро- нидазы, а ген cfb отвечает за образование CAMP-фактора у стрептококков группы В, биологическая активность которого заключается в расширении зоны гемолиза, вызванного ^-гемолизином золотистого стафилококка.

Ген uidA кишечной палочки, а также ген cfb стрептококков Streptococcus agalactiae представляют собой уникальные для данных видов гены, не встречающиеся у эволюционно родственных видов и родов микроорганизмов и не имеющие близких гомологов в геномах бактерий других родов.

В настоящее время у бактерий рода Klebsiella не описаны уникальные гены, характерные строго для этого рода. В этой связи задача создания родоспецифичного набора для детекции бактерий Klebsiella spp. решалась путем поиска консервативных районов в гене ^S-рРНК, отличающихся у бактерий рода Klebsiella от последовательностей бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae. Один из таких участков был выбран в качестве мишени для разработки родоспецифичных диагностических ПЦР-праймеров и зонда для детекции патогенов рода Klebsiella. Дизайн праймеров, комплементарных данному участку, осуществлялся таким образом, чтобы 3’-терминаль- ные и/или субтерминальные нуклеотидные остатки были комплементарны родоспецифичным остаткам в последовательностях ^S-рРНК. Для изучения специфичности полученных праймеров и олигонуклеотидных зондов, предназначенных для одновременной детекции E. coli, S. agalactiae, Klebsiella, было проведено тестирование созданного мультипраймерного набора на препаратах ДНК, полученных из 32 штаммов бактерий различных видов: Citrobacter sp., Enterobacter sp., Proteus sp., Streptococcus anginosus, S. lactis, S. pyogenes, Enterococcus sp. Было показано, что разработанные пары праймеров и зонды реагируют лишь с ДНК из соответствующих видов бактерий.

Для достоверности количественного определения ДНК и эффективности протекания ПЦР-реакций в разработанном мультипраймерном наборе были проведены серии экспериментов с использованием в качестве матрицы серийных десятикратных разведений смеси геномных ДНК, выделенных из E. coli, S. agalactiae, Klebsiella, находившихся в экспоненциальной фазе роста. Динамический диапазон измерений составил 7 порядков. В результате этого эксперимента была продемонстрирована способность созданного набора обеспечивать линейное определение количества ДНК в широком диапазоне концентраций. В качестве ДНК внутреннего контроля была получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент гена GFP Aequorea victoria.

Для выделения бактериальной ДНК из клинического материала был разработан протокол, основанный на сочетании метода Бума (лизис хао- тропной солью и адсорбция ДНК на диоксиде кремния) с предварительным разрушением клеточных стенок грамположительных бактерий (стрептококков) путем последовательной обработки лизоцимом и протеиназой К в буфере оптимального состава.

Наилучшие результаты как для S. agalactiae, так и для Klebsiella, были продемонстрированы при использовании метода Бума с обработкой гидролитическими ферментами.

Для оценки чувствительности и специфичности набора реагентов были проведены его испытания на серии клинических образцов, полученных из отделения патологии новорожденных, а также на наборе симулированных клинических образцов, полученных путем добавления чистых культур детектируемых возбудителей в образцы биологических жидкостей (слюна, моча, цельная кровь с консервантом ЭДТА), полученные от здоровых волонтеров.

Исследование данных образцов показало высокую специфичность разработанного набора, а также более высокую чувствительность по сравнению с классическим бактериологическим методом.

Таким образом, современный уровень диагностики, основанной на молекулярных методах исследования, позволяет быстро и с высокой точностью выявлять инфекционные заболевания у новорожденных, вызванные как вирусами, так и бактериями.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка
      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...







      Наши продукты






















      © 2006–2018 ООО «МЦФЭР», медиагруппа «Актион-МЦФЭР»

      Журнал «Здравоохранение» –
      практический журнал для главного врача.

      Все права защищены. Полное или частичное копирование любых материалов сайта возможно только с письменного разрешения редакции журнала «Здравоохранение».
      Нарушение авторских прав влечет за собой ответственность в соответствии с законодательством РФ.

      Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
      Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать документ на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 12 000 статей
      — 8 000 ответов на вопросы
      — 200 видеосеминаров
      — готовые формы и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные сервисы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×