text
Портал для медицинских работников

Дифференциальная диагностика атипичных вариантов и редких форм зрелых В-клеточных неоплазм

  • 15 августа 2012
  • 37

При иммунофенотипировании новообразований из зрелых В-лимфоцитов с помощью метода проточной цитометрии, возникают сложности в диагностике нозологической формы лейкоза, если иммунофенотипические характеристики отклоняются от “классических”. В таких случаях установить диагноз позволяют цитогенетические и морфологические методы исследования. В настоящее время продолжают накапливаться данные о разнообразии форм опухолей из зрелых В-клеток. Так, в классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2008 г. в разделе зрелых В-клеточных неоплазм появились новые нозологические формы, такие как макрогло- булинемия Вальденстрема (МГВ), ALK-позитивная В-крупноклеточная лимфома (ALK+ВККЛ) и вариантный волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ; временный термин). Но и среди перечисленных классификацией ВОЗ нозологических форм опухолей из зрелых В-клеток встречаются варианты с иммунофенотипическими, цитогенетическими и морфологическими особенностями, отличающимися от принятых характеристик.

Обычно окончательный диагноз хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ) ставится при наличии триады антигенов CD19+, CD5+, CD23+, что также подтверждается присутствием слабой экспрессии поверхностного SmIg, моноклональностью злокачественных В-клеток по типу легких полипептидных цепей иммуноглобулинов (к или А.). Тем не менее данный подход к верификации диагноза В-ХЛЛ не включает CD5- негативные варианты заболевания и более редкие варианты с аномальной экспрессией пан-В-клеточных антигенов и антигена CD23. Как правило, идентификация случаев с типичными для В-ХЛЛ иммунофенотипическими характеристиками (SmIgdim, CD5+, CD23+) ассоциирована с более благоприятным прогнозом, по сравнению с другими зрелыми В-клеточными лейкозами, при которых наблюдается различная экспрессия одного из этих трех маркеров. При атипичной морфологии опухолевого клона и повышении содержания пролимфоцитов, как правило, наблюдается снижение уровня экспрессии антигена CD23 на лейкозных В-лимфоцитах.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Недавно появились сообщения о CD23-позитивных случаях лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ). Однако в этих исследованиях оценивалось относительное количество клеток, экспрессирующих антиген CD23, а не степень интенсивности флуоресценции данного антигена. В настоящее время имеются публикации, свидетельствующие, что высокий процент CD23-позитивных клеток (более 92,5%) и/или высокая интенсивность флуоресценции антигена CD23, как правило, отмечаются при В-ХЛЛ, тогда как низкий уровень их содержания (менее 30%) регистрируется у пациентов с ЛКМЗ. В то же время содержание CD23+ В-лимфоцитов в пределах 30,092,5% и более низкая интенсивность флуоресценции встречаются как при В-ХЛЛ, так и при ЛКМЗ. В этих случаях для дифференциальной диагностики между В-ХЛЛ и ЛКМЗ используют дополнительные методы, такие как FISH-анализ транслокации t(11 ;14) и иммуногистохимическая детекция гиперэкспрессии циклина D1.

Наиболее специфичным маркером для диагностики ВКЛ является обнаружение антигена CD103 на мембране лейкозных клеток, т. к. он экспрессируется лишь на минорных популяциях В-лимфоцитов и на Т-лимфоцитах, ассоциированных со слизистыми. Тем не менее не так давно стали появляться сообщения об отсутствии экспрессии антигена CD103 на ВКЛ-лимфоцитах.

В настоящем исследовании представлены 5 случаев нетипичных вариантов (отклоняющихся по своим свойствам от характеристик, принятых классификацией ВОЗ) редких форм зрелых В-клеточных опухолей и дается описание их иммунофенотипических, цитогенетических и морфологических особенностей.

Иммунофенотипирование клеток костного мозга больных с подозрением на лимфопролиферативное заболевание выполняли в два этапа на проточном цитометре Cytomics FC500 фирмы Beckman Coulter (США) с использованием различных тройных комбинаций следующих прямых моноклональных антител и соответствующих изотипических контролей той же фирмы: CD3FITC, CD19PE, CD19PC5, CD45PC5, CD10FITC, CD20PE, CD4PE, CD8PE, SmIgkFITC, SmIg\FITC, CD5FITC, CD23PE, FMC7FITC, CD38PE, CD22FITC, CD79bPE, CD25FITC, CD11c, CD103FITC, CD24PE.

Экспрессию маркера считали позитивной, если его экспрессировали не менее 20,0% анализируемых клеток. Сигнал интенсивности экспрессии антигенов определяли как слабый (dim), если антиген-позитивные клетки четко не отделялись от негативного контроля (интенсивность флуоресценции меньше или равна 102), как умеренный (mod) - если антиген-позитив- ные клетки четко отделялись от контроля и располагались в интервале от 102 до 103, и как яркий (bright) - если интенсивность флуоресценции превышала 10. Для проведения цитогенетического анализа клетки костного мозга культивировали в течение 24 ч, периферическую кровь - в течение 72 ч, используя стандартные методики. Анализ препаратов проводили при увеличении 1000 на светооптическом микроскопе фирмы Opton. Повреждения хромосом учитывали по международной номенклатуре. Для выявления специфичных для В-ХЛЛ аберраций использовали метод флуоресцентной in situ гибридизации. Для этого метода применяли ДНК-зонды фирмы “ABBOT”.

Случай В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, негативного по антигену CD23. Иммунологические маркеры позволяют отличить В-ХЛЛ от других лимфопролиферативных заболеваний и имеют определенное прогностическое значение для пациентов с В-ХЛЛ. Иммунофенотип опухолевых клеток при данном заболевании обладает рядом особенностей. Типичный В-ХЛЛ характеризуется следующим иммунофенотипом: CD19+, CD5+, CD23+, SmIgdim+, CD20dim+, FMC7-/dim, CD79b-/dim, CD22-/dim. Ведущее значение в диагностике В-ХЛЛ играют антигены CD5 и CD23. Большинство случаев В-ХЛЛ являются позитивными по антигену CD23 (рецептор FcsRII, маркер активации В-лимфоцитов), экспрессия которого не обнаруживается при ряде других В-клеточных малигнизаций.

Случай В-ХЛЛ, негативного по антигену CD23 (СD5+CD23-В-ХЛЛ), представлял собой сложную диагностическую задачу, поскольку клетки при ЛКМЗ в фазе лейкемизации также позитивны по антигену CD5 и негативны по антигену CD23. Как выяснилось впоследствии, имел место рецидив типичного CD5+CD23+B-ХЛЛ, первично диагностированного 7 лет назад. При исследовании методом проточной цитометрии клеток костного мозга больного (возраст 80 лет) было обнаружено изменение иммунофенотипа лейкозных клеток при рецидиве. Опухолевые лимфоциты демонстрировали В-клеточное происхождение. Лейкозные В-клетки в этом случае характеризовались более высокой интенсивностью экспрессии антигена CD20 (dim to mod, MFI = 170 ед.) и SmIgK (mod, MFI = 653 ед.), в отличие от типичного В-ХЛЛ. Экспрессия антигена CD23 на аномальных В-лимфоцитах отсутствовала.

По другим признакам этот иммунофенотипический вариант соответствовал “классическому” В-ХЛЛ, т. е. трансформированные лимфоциты были негативны по антигенам FMC7, CD22 и слабопозитивны по антигену CD79b, что отличало этот вариант лейкоза от ЛКМЗ, всегда позитивной по экспрессии данных антигенов. На 98,0% лейкозных В-лимфоцитов экспрессировался антиген CD38, считающийся маркером неблагоприятного прогноза течения В-ХЛЛ.

При цитогенетическом исследовании у данного пациента была обнаружена трисомия по хромосоме 12, характерная для В-ХЛЛ, также связанная с неблагоприятным прогнозом.

Таким образом, общей иммунофенотипической чертой типичного и атипичного вариантов В-ХЛЛ является отсутствие экспрессии (или слабая экспрессия) антигенов FMC7, CD22 и СD79b.

В свою очередь, иммунофенотип CD5+CD23-В-ХЛЛ характеризуется более высокой интенсивностью экспрессии антигенов CD20, SmIgk.

Случай лимфомы из клеток мантийной зоны, позитивной по антигену CD23. При обнаружении ЛКМЗ, позитивной по антигену CD23, необходимо проводить дифференциальную диагностику с В-ХЛЛ. Морфологическое исследование костного мозга больного (возраст 83 года) показало, что лимфоидный росток расширен до 31,2%, лимфоциты характеризовались омоложенным хроматином ядра и клазматозом цитоплазмы.

Анализ методом проточной цитометрии показал, что опухолевые клетки пациента экспрессировали антигены CD19, CD20, CD5, CD23, но при этом характер их экспрессии отличался от наблюдаемого при В-ХЛЛ. Во-первых, интенсивность экспрессии антигена CD20 при данной форме ЛКМЗ была умеренной (mod, MFI = 413 ед.), против слабой (dim), характерной для классического В-ХЛЛ. Во-вторых, антиген СD23 экспрессировался на 90,0% лейкозных В-клеток и его экспрессия носила гетерогенный характер. Трансформированные лимфоциты также экспрессировали антигены FMC7, CD79b и CD22, которые, как правило, отсутствуют при В-ХЛЛ или слабопозитивны. Клональность В-лимфоцитов доказана обнаружением преимущественной экспрессии легких к-цепей иммуноглобулинов.

Цитогенетическое исследование выявило следующий кариотип: 46,XY; 46,XY,t(9;15)(p13q11); 46,XY,del(6)(q23). Транслокация t(9;15) встречается сравнительно редко, но при многих видах лимфом, в т. ч. При ЛКМЗ, для которой характерен разрыв в 9р 13, где локализуется ген РАХ5 - ключевой регулятор развития и дифференцировки В-клеток. Наиболее значимым оказалось обнаружение специфичной для ЛКМЗ транслокации t(11 ;14) (q13;q32). Сопоставление данных морфологических, иммунофенотипических и цитогенетических исследований позволило поставить окончательный диагноз - ЛКМЗ.

Случай вариантного волосатоклеточного лейкоза со сниженной экспрессией антигена CD 103. При морфологическом исследовании костного мозга у пациентки с подозрением на ВКЛ было обнаружено 5,6% ВКЛ-лимфоцитов. Анализ крови выявил наличие трехростковой цитопении. Лейкоциты составили 2,1 х 109/л.

Анализ методом проточной цитометрии показал, что в лимфоцитарном окне находится порядка 31,4% В-лимфоцитов. Тот факт, что В-лимфоциты не являются “нормальными”, доказывали чрезвычайно яркая (bright) интенсивность экспрессии антигенов CD19 (MFI = 1711 ед.), CD20 (MFI = 2580 ед.), CD22 (MFI = 3780 ед.) и преимущественная экспрессия легких \-цепей иммуноглобулинов - 80,7%. Анализ иммунофенотипического профиля ВКЛ-лимфоцитов (2,2 %) в выделенном окне показал, что, хотя критерием вариантной формы ВКЛ является отсутствие лейкопении, в отличие от “классической” формы ВКЛ (позитивной по антигенам CD103, CD11c и CD25), лейкозные клетки в данном случае почти не экспрессировали антиген CD103 (только 10,3% от ВКЛ-лимфоцитов), а экспрессия антигена CD25 полностью отсутствовала. В некоторых публикациях также были описаны случаи CD103- и CD25-негативных ВКЛ. Трансформированные В-лимфоциты были позитивны по антигену CD11^ что характерно для ВКЛ, но при этом слабопозитивны (dim) по антигенам FMC7 и CD79b, что отличало данный вариант от более яркой экспрессии этих антигенов при типичном ВКЛ.

Таким образом, иммунофенотипические особенности ВКЛ-клеток в данном случае позволили установить вариантную форму ВКЛ.

Случай АЛК-позитивной В-крупноклеточной лимфомы.

У больного (возраст 62 года), проходящего стационарное лечение по поводу гипертонической болезни, в периферической крови был обнаружен незначительный относительный (50,0%) и абсолютный лимфоцитоз (4,75 х 109/л).

В протеинограмме присутствовал гамма-парапротеин - 21,3%.

Морфологическое исследование стернального пунктата выявило гиперплазию лимфоидного ростка до 50,4%. Лимфоциты представлены опухолевыми лимфоидными клетками небольшого размера, неправильной формы, с грубым хроматином и узким ободком цитоплазмы.

Иммунофенотипическое исследование клеток цельного костного мозга в лимфоцитарной области выявило преобладание субпопуляции В-лимфоцитов (CD19) - 69,2%. Моноклональная природа клеток доказана обнаружением экспрессии легких А-цепей иммуноглобулинов фактически на всех В-лимфоцитах - 98,3%. Наряду с антигеном CD19 опухолевые лимфоциты экспрессировали и другие антигены зрелых В-клеток - CD20, CD22(слабо), CD79b, CD24, FMC7 (слабо).

Интенсивность экспрессии антигена CD20 была умеренной, MFI = = 460 ед., а SmIgA - яркой, MFI = 2700 ед., в отличие от слабой экспрессии данных антигенов при В-ХЛЛ. Экспрессия антигенов CD23 и CD5, характерных для В-ХЛЛ, также отсутствовала.

Более яркая интенсивность экспрессии антигена CD19 (MFI = 915 ед.) и отсутствие экспрессии антигена CD5 отличали данный случай от ЛКМЗ, для которой характерна позитивность по антигену CD5 и интенсивность экспрессии антигена CD19 ближе к слабой.

Опухолевые клетки костного мозга в рассматриваемом случае лимфомы были негативны по антигену CD11c, что отличало ее от лимфомы селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами, всегда позитивной по данному антигену. Кроме того, трансформированные лимфоциты не экспрессировали антигены CD103, CD10 и CD25, что исключало диагноз ВКЛ (позитивного по антигенам CD103, CD25 и негативного по антигену CD24) или фолликулярной лимфомы (позитивной по антигену CD10).

Обнаруженная аберрантная слабая экспрессия антигена CD4 (36,0%), который не экспрессируется на В-клетках, также несвойственна зрелым В-клеточным опухолям.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование трепан- биоптата костного мозга обнаружило распространенные зоны диффузной (преимущественно) и интерстициальной инфильтрации мелкими лимфоцитоподобными клетками, пролимфоцитами и центритоподоб- ными клетками. Подавляющее большинство лимфоидных клеток интенсивно экспрессировало на мембране антиген СD20, при этом отсутствовала экспрессия антигенов CD10, CD23 и циклина D1.

В результате проведенных исследований выдвинуто предположение о наличии у больного диффузной неходжкинской лимфомы с вовлечением в патологический процесс костного мозга, с “низкой степенью злокачественности”, IV A с поражением парагастральных, парааортальных, брыжеечных, паракавальных, подвздошных лимфатических узлов, костного мозга.

Цитогенетическое исследование периферической крови (100 клеток) выявило следующие хромосомные повреждения: 46,xy,t(2;5)(p23;q35); 46,xy,t(4;4); 47,xy,+21. Наибольший интерес представляло обнаружение транслокации t(2;5)(p23;q35).

С хромосомной транслокацией t(2;5)(p23;q35), как правило, ассоциированы анапластические крупноклеточные ALK-позитивные лимфомы, Т-клеточного или 0-клеточного фенотипа, экспрессирующие антиген CD30. В результате транслокации t(2;5)(p23;q35) происходит слияние гена нуклеофосмина (NPM), расположенного в участке хромосомы 5q35, с геном киназы (ALK), расположенным в участке хромосомы 2p23, что приводит к появлению химерного протеина с тирозинкиназной активностью.

ALK-позитивная B-крупноклеточная лимфома (ALK+ВККЛ) является редкой агрессивной опухолью, негативной по антигену CD30 (более 95,0%), и отличается от диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (Д№КЛ), неуточненной, морфологическими, иммунофенотипическими и цитогенетическими характеристиками. Больные данным заболеванием плохо отвечают на химиотерапию. Этот тип лимфомы составляет менее 1,0% от Д№КЛ. С момента первой публикации Delsol et al. в 1997 г. было сообщено приблизительно о 50 случаях ALK+ВККЛ. В свою очередь, сведения о транслокации t(2;5)(p23;q35) и/или слиянии NPM1-ALK, выявляемых ядерным и цитоплазматическим AKL-окрашиванием, составляли 10,0% от случаев ALK+ВККЛ с участием других ALK-транслокаций, таких как t(2;17)(p23;q23) - слияние генов clathrin-ALK, и t(2;3) (p23;q27) - слияние генов SEC31A- ALK. Тем не менее в указанных работах описывались морфологические, иммуногистохимические и иммунофенотипические особенности опухолевых образований в различных тканях, за исключением лейкемизированных клеток костного мозга.

По литературным данным, частота экспрессии антигена CD4 на клетках опухоли составляет 40,0-64,0%, CD20 - только 3,0-8,0%, k- или Л.-цепей иммуноглобулинов - 90,0%, а CD138, ALK, EMA (эпителиальный мембранный антиген) -100% случаев.

Случай макроглобулинемии Вальденстрема. МГВ - довольно редкая форма зрелоклеточных В-лимфом. Она встречается в 10 раз реже, чем множественная миелома, и составляет около 2,0% всех гемобластозов. Для этого варианта лимфоплазмоцитарной лимфомы характерны вовлечение в опухолевый процесс костного мозга и наличие моноклонального IgM. Гетерогенность морфологического субстрата определяет и иммунофенотипическое разнообразие опухолевых клеток при МГВ. В сыворотке крови больного (возраст 79 лет) было обнаружено сильное повышение IgM (более 15 г/л). При исследовании белковых фракций сыворотки крови отмечалось существенное повышение гамма-глобулинов - 32,0% (в норме 11,5-18,6%). Гистологическое исследование трепанобиоптата выявило гиперклеточность костного мозга за счет выраженной В-клеточной интерстициальной инфильтрации, состоящей из малых лимфоцитов, пролимфоцитов, центроцитоподобных и плазматических клеток.

Анализ лимфоцитов костного мозга методом проточной цитометрии обнаружил позитивную экспрессию антигенов CD19, CD20, а также наличие других В-клеточных антигенов - CD22, CD79b, CD25.

Злокачественность В-лимфоцитов подтверждала тотальная экспрессия поверхностных легких к-цепей иммуноглобулинов и поверхностного IgM. Опухолевые клетки были негативны по экспрессии антигенов CD5, CD10, FMC7, CD11c.

Сопоставление клинических, морфологических и иммунофенотипических данных позволило поставить окончательный диагноз МГВ. Особенностью этого случая явилось обнаружение на лимфомных клетках слабопозитивной экспрессии антигена CD23, что редко встречается при МГВ. Экспрессия антигена CD38, часто выявляемая при МГВ, также не была зафиксирована. По-видимому, количество плазматических клеток в опухолевом субстрате было незначительным. Цитогенетическое исследование костного мозга обнаружило большое количество повреждений неклонального характера.

Иммунофенотипические и цитогенетические исследования в дополнение к морфологическим дали возможность выявить особенности редких форм опухолей из зрелых В-клеток, которые позволили провести дифференциальную диагностику между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, ВКЛ и вариантной формой ВКЛ, Д№КЛ и ALK+ВККЛ, а также оценить прогноз течения заболевания.

Анализ показал, что у пациента с CD23-негативным В-ХЛЛ, в отличие от случаев с ЛКМЗ, отсутствовала экспрессия антигенов CD22, FMC7 и наблюдалась слабая позитивность по антигену CD79b. О плохом прогнозе свидетельствовали отсутствие экспрессии антигена CD23, высокий процент CD38+ клеток (97,0%) и трисомия по хромосоме 12.

В случае CD23-позитивной ЛКМЗ для дифференциальной диагностики с В-ХЛЛ наибольшее значение имели умеренная экспрессия антигена CD20 (mod), положительная экспрессия антигенов CD22, FMC7, CD79b и обнаружение транслокации t(11;14).

Решающую роль в диагностике вариантной формы ВКЛ, негативного по антигену CD103, сыграли обнаружение ВКЛ-клеток при морфологическом исследовании и наличие высокой интенсивности флуоресценции (более 1000 ед.) антигенов CD19, CD20 и CD22 при анализе методом проточной цитометрии. В свою очередь, наиболее важным критерием для дифференциальной диагностики между ВКЛ и вариантной формой ВКЛ послужило отсутствие антигена CD25 на мембране лейкозных клеток.

Цитогенетические исследования, выявившие транслокацию t(2;5), а также аберрантная экспрессия антигена CD4 на В-клетках позволили провести дифференциальный диагноз между ALK+ВККЛ и ДКВКЛ. В свою очередь, транслокация t(2;5) свидетельствует о плохом прогнозе.

Особенностью случая МГВ явилось обнаружение на лимфомных клетках слабопозитивной экспрессии антигена CD23, которая редко встречается при данном заболевании.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.