text
Портал для медицинских работников

Разнообразие видов микроскопических грибов, выявленных в урогенитальном тракте женщин

  • 15 ноября 2012
  • 27

Микозы - широко распространенные заболевания человека, вызываемые микроскопическими грибами. Большинство патогенных для человека видов микроскопических грибов относятся к порядкам Saccharomycetales, Eurotiales, Tremellales, Capnodiales, Malasseziales. Клиническое течение микоза зависит от вида возбудителя, локализации и степени поражения. Микозы зачастую носят хронический характер и трудно поддаются лечению. Важнейшим фактором, обусловливающим развитие микозов, является ослабление иммунитета или иммуносупрессия. Кандидоз слизистых оболочек возникает почти у каждого больного с иммунодефицитом. Однако кандидоз слизистых (в частности, кандидозный вагинит) часто развивается и при незначительных изменениях в иммунном статусе больного. Около 75,0% женщин репродуктивного возраста хотя бы один раз в жизни переносят кандидозный вагинит, 40,0-45,0% болеют им два и более раз. Примерно у 5,0% больных развивается рецидивирующий кандидозный вульвовагинит.

В последние годы большое внимание уделяется инвазивным канди- дозам, развивающимся во внутрибольничных условиях, а также неонатальным кандидозам, поскольку инфекции, вызванные грибами рода Candida, связаны с высокими показателями младенческой смертности. Недавние исследования показали, что Candida spp. является третьим по частоте возбудителем, изолированным из кровотока, и только бактерии Staphylococcus epidermalis и Staphylococcus aureus превосходят эти грибы по частоте встречаемости при госпитальной септической инфекции.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

Несмотря на то что участие в патологических процессах показано для более чем 200 видов грибов, подавляющее большинство случаев грибковых поражений слизистых оболочек приходится на долю кандидозов. Показано, что кандидоз могут вызывать несколько десятков видов грибов рода Candida. В настоящее время наиболее эпидемиологически значимыми при кандидозах принято считать виды C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, из которых наиболее распространенным и вирулентным остается C. albicans. Однако с 1990-х гг. отмечается устойчивое увеличение относительной частоты встречаемости не-albicans видов рода Candida, вызывающих кандидоз, эпидемиологическая значимость которых может отличаться в зависимости от региона. Так, в исследовании Horn с соавторами, проведенном в США, C. albicans выявлена в 46,5% случаев кандидоза, а второй по частоте оказалась C. glabrata (26,0%); для других регионов (Латинская Америка, Испания) при микозах была показана более высокая выявляемость C. parapsilosis. В целом доля не-albicans видов дрожжеподобных грибов в развитии патологии человека может варьировать от 14,0 до 50,0%. Изменения в видовом составе могут быть обусловлены еще и тем, что среди большинства не-albicans видов широко распространена устойчивость ко многим современным антимикотикам, что приводит к распространению этих форм и значительно осложняет проведение эффективной терапии. Предполагают, что применение флуконазола повлияло на возрастание роли инфекции, вызванной C. glabrata и C. krusei, поскольку штаммы C. glabrata нередко резистентны к флуконазолу, а штаммы C. krusei фактически полностью резистентны к азоловым антимикотикам. Помимо грибов рода Candida, при определенных условиях патогенными для человека являются и другие микроскопические грибы порядков Saccharomycetales, Eurotiales, Tremellales, Capnodiales, Malasseziales и др..

В России, как и во всем мире, большинство работ по изучению видовой принадлежности патогенных микроскопических грибов выполнено с применением культуральных методов, основанных на изучении ростовых свойств грибов на плотных питательных средах (изменение формы, цвета колоний, утилизация углеводов и т. д.). Так, применение ChromAgar позволяет дифференцировать некоторые виды Candida по их окраске. Тем не менее указанные методы далеко не всегда позволяют достоверно определить вид микроскопического гриба. В последнее время стали использовать и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК грибов, однако в большинстве случаев проводится определение только C. albicans. Данные по распространенности в разных регионах России различных видов микроскопических грибов при микозах малочисленны.

В настоящей работе представлены результаты анализа выявления ДНК микроскопических грибов, установления их видовой принадлежности и оценка количественного содержания в образцах случайной выборки соскобов из урогенитального тракта женщин. Шестьсот сорок девять и 620 урогенитальных соскобов были собраны и любезно предоставлены отделениями лаборатории “ИНВИТРО” (в Москве и Новосибирске) и автономной некоммерческой организацией “Центр новых медицинских технологий в Академгородке” (АНО ЦНМТ) г. Новосибирска соответственно. Урогенитальный соскоб помещали в транспортный раствор объемом 300 мкл. Выделение нуклеиновых кислот проведено с помощью набора реагентов “РеалБест экстракция 100” (ЗАО “Вектор-Бест”, г. Новосибирск) из 100 мкл суспензии клеток урогенитального соскоба в соответствии с инструкцией.

Выявление ДНК микроскопических грибов без определения вида и рода проводили с использованием разработанной авторами тест-системы на основе ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Праймеры и зонд, входящие в систему детекции, выбраны на консервативных участках гена 5,8S рРНК, позволяющих детектировать ДНК грибов порядков Saccharomycetales, Eurotiales, Tremellales, Capnodiales, Malasseziales и др. Выявление ДНК Candida albicans проводили с использованием набора “РеалБест ДНК Candida albicans”, праймеры и зонд, входящие в систему детекции, соответствуют консервативным участкам гена протеинкиназы C. albicans (ЗАО “Вектор-Бест”).

При анализе использован внутренний контрольный образец (ВКО), который добавляется ко всем исследуемым пробам и проходит вместе с ними все стадии анализа, включая выделение ДНК. Амплификация ДНК ВКО регистрируется в реальном времени при помощи отдельной валиди- рованной тест-системы, что позволяет отслеживать потери ДНК в процессе пробоподготовки и контролировать процесс ПЦР в целом. Кроме того, для контроля качества взятия материала все исследованные пробы были тестированы для выявления ДНК человека с использованием набора “РеалБест Валидация образца” (ЗАО “Вектор-Бест”). Пробы с низким содержанием ДНК человека были исключены из анализа.

Выявление ДНК микроскопических грибов проводили на амплифи- каторе с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Количественную оценку проводили с помощью калибровочной кривой, для построения которой применяли результаты анализа серии разведений стандартного образца. Стандартные образцы представляли собой синтетические фрагменты ДНК, включавшие анализируемую мишень, разведенные транспортным раствором до известной концентрации.

Установление видовой принадлежности микроскопических грибов проведено при помощи секвенирования вариабельных участков генов 18S рРНК и 28S рРНК, а также последовательности 5,8S рРНК-ITS2. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 18S рРНК (310 п. н.), 28S рРНК (620 п. н.) и 5,8S-ITS2 (550 п. н.) определены с использованием подобранных нами праймеров, соответствующих анализируемому ПЦР- фрагменту, и набора Big DyeTM Terminator Cycle Sequendng Kit и проанализированы в Центре коллективного пользования СО РАН “Геномика”.

Сравнение и анализ полученных нуклеотидных последовательностей выполнены с помощью программ BlastN  и MEGA 5.0. Филогенетический анализ проведен с использованием метода попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPMGA) с помощью программы MEGA 5.0.

Первоначально все 1269 женских урогенитальных соскобов, собранных в клиниках г. Новосибирска и Москвы, были проанализированы для выявления ДНК микроскопических грибов без разделения на виды. ДНК грибов была выявлена в 250 образцах (40,3%) соскобов новосибирской выборки и 284 образцах (43,8%) московской выборки в количестве 104-107 копий на соскоб. Образцы с нагрузкой менее чем 104 копий на соскоб считались отрицательными. Затем во всех образцах было проведено определение ДНК C. albicans, которая была выявлена в 195 образцах (15,4% от всех исследованных, или 36,5% от тех, в которых найдена ДНК грибов). Для остальных 299 образцов, содержащих ДНК грибов, было проведено определение нуклеотидных последовательностей вариабельных фрагментов генов 18S рРНК, 28S рРНК и 5S рРНК - ITS2. В 40 случаях определить нуклеотидную последовательность не удалось из-за присутствия двух и более видов микроскопических грибов в одном соскобе.

Анализ данных, полученных при установлении видовой принадлежности, показал, что в 72,0% случаев микроскопические грибы, детектируемые в урогенитальном тракте женщин, относятся к дрожжеподобным грибам и представлены грибами рода Candida. Помимо дрожжеподобных грибов, в урогенитальном тракте женщин выявлены плесневые грибы родов Aspergillus spp, Cryptococcus spp, Trichosporon spp. (12,5%), а также неклассифицированные микроскопические грибы (15,5%).

Наиболее часто встречающимся видом среди грибов рода Candida ожидаемо оказалась C. albicans (58,6%). Помимо C. albicans, мы выявили ДНК еще 12 видов грибов рода Candida, 8 из них входят в десятку наиболее часто обнаруживаемых видов. Полученные результаты, однако, отличаются от приводимых в литературе: среди не-albicans видов не выявлено преобладание C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, их встречаемость составила 5,4%. Следующими после C. albicans по частоте встречаемости оказались C. palmioleophila (18,6%) и C. guilliermondii и (6,6%). Остальные образцы были представлены C. pelliculosa, C. famata, C. lusitaniae, C. sojae, C. zeylanoides и C. lactis- condensi (10,8%).

Количественные оценки содержания микроскопических грибов в образцах были проведены для каждой пробы. Распределение по содержанию ДНК грибов для трех групп образцов:

  • содержавших C. albicans;
  • содержавших другие виды грибов рода Candida;
  • содержавших виды грибов, не относящиеся к роду Candida.

Настоящее исследование было предпринято с целью ответить на вопрос, насколько доступные на рынке тесты для выявления видов грибов достаточны для определения этиологии микозов слизистых урогенитального тракта.

Доступные на российском и зарубежном рынке диагностические системы для генодиагностики микозов преимущественно ориентированы на определение C. albicans, чего явно недостаточно, поскольку в этом случае 30,0-50,0% и более случаев микозов могут остаться недифференцированными. Так, в нашей работе ДНК C. albicans была выявлена лишь в 37,3% положительных образцов, содержащих ДНК микроскопических грибов.

В последнее время появились тесты, позволяющие детектировать и некоторые другие виды микроскопических грибов. Диагностический набор АмплиСенс® С.а1Ысап8/С^1аЬга1а/С.кги8е1-МУЛЬТИПРАЙМ-РЬ (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) позволяет выявлять C. glabrata и C. krusei. Зарубежные тесты также предлагают выявлять не-а1Ысаш виды, некоторые из тестов имеют несколько более широкий спектр выявляемых видов: C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei (Quest Diagnostics, Сап&ёа DNA, Qua1itative Леа1-Т1ше PCR (USA)); C. dubliniensis, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis (Мусс^еа1 СапШёа (АшШа)). Однако очевидно, что видовое разнообразие микроскопических грибов, колонизирующих урогенитальный тракт человека, значительно шире этого перечня. В нашей работе при анализе достаточно ограниченной выборки выявлены ДНК 13 видов грибов рода Candida, и этот результат не является неожиданным, поскольку 9 из них входят в десятку наиболее часто обнаруживаемых при микозах. Следующими по частоте встречаемости после C. albicans оказались C. palmioleophila и C. guilliermondii, что отличается от данных, приводимых в литературе, согласно которым среди не-albicans преобладают C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei. Подчеркнем, что результаты анализа двух выборок из географически отдаленных регионов оказались близки, хотя, безусловно, нельзя исключить того, что на других выборках может быть обнаружено иное соотношение не-а1Ысаш видов. Более того, видовое разнообразие грибов при микозах не ограничивается родом Candida. В любом случае существует высокая вероятность, что рутинный ДНК- тест не определит присутствие микроскопических грибов в пробе, где они заведомо имеются (так, например, при анализе нашей выборки набором Quest Diagnostics, исходя из построения этого набора, 40,0% образцов дрожжеподобных грибов были бы не определены, в т. ч. 28,0% образцов с нагрузками 105 копий/мл образца и выше).

Можно отметить, что для ДНК C. albicans в целом характерна более высокая концентрация в пробах. Тем не менее в ряде случаев ДНК грибов других видов (в т. ч. не относящихся к роду Candida) также была выявлена в значительной концентрации, которая, согласно литературным данным, может являться клинически значимой (более 104-105 копий/мл образца, и даже более 108), что не позволяет игнорировать присутствие этих видов при определении этиологической причины микоза.

Таким образом, встает вопрос о необходимости создания теста молекулярной диагностики, позволяющего определять максимальное количество видов микроскопических грибов. При тестировании представляется целесообразной полуколичественная или количественная оценка для определения клинически значимых концентраций грибов, поскольку все они могут быть отнесены к условно патогенным микроорганизмам. Для осуществления такой оценки безусловно актуально применение метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Возможны два подхода к построению подобного теста: дифференцированное определение видов, предполагающее существенное усложнение теста (и следовательно, удорожание анализа), и недифференцированное определение, дающее первичную информацию о наличии микроскопических грибов. На наш взгляд, второй подход более экономически обоснован и может быть использован в качестве скринингового, но он может и потребовать последующего определения вида возбудителя для выбора стратегии лечения, поэтому задача анализа видового разнообразия грибов при микозах и определения особенностей заболевания, вызываемого разными видами, не теряет актуальности.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.