ПЦР-диагностика анаэробных инфекций, вызываемых бактериями рода Bacteroides

52

В настоящее время отмечается значительное увеличение доли инфекционных заболеваний, в патогенезе которых ведущую роль играют анаэробные бактерии. Подобные инфекции, как правило, полимикробные, при этом анаэробные возбудители встречаются в ассоциации с другими анаэробными или аэробными микроорганизмами.

Выявление анаэробных микроорганизмов традиционно является серьезной проблемой для клинической бактериологической лаборатории. Большинство видов плохо культивируются или не культивируются вообще, кроме того, стандартные микробиологические методы длительны и их результаты становятся известны лишь на 3-4-й день от момента взятия материала. Однако во многих случаях, в частности при развитии анаэробной инфекции в ранах у хирургических больных, времени на длительные исследования просто нет, поскольку необходим срочный выбор адекватной антибактериальной терапии.

Ускорить диагностику и определить антибиотикорезистентность анаэробных бактерий, вызывающих тяжелые инфекции человека, возможно путем применения в практике бактериологических лабораторий новых методов на основе анализа генетического материала бактерий, в частности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Возбудителей анаэробных инфекций принято разделять на две группы. К первой группе относят спорообразующих анаэробов, или клостридий. Вторая группа представлена неспорообразующими, или некло- стридиальными, анаэробами (бактероиды, фузобактерии, пептококки, пептострептококки и др.).

Анализ видового состава бактерий, выделяемых из очагов воспаления с участием анаэробной микрофлоры, показал, что среди неспорообразующих анаэробов основную долю составляют Bacteroides fragilis (85,7%), Peptococcus spp. (71,4%), Peptostreptococcus spp. (69,8%), Prevotella melaninogenica (68,7%), Fusobacterium nucleatum (42,6%). Частота выделения неспорообразующих анаэробов при тяжелых гнойных заболеваниях колеблется от 57,1 до 98,8%, в зависимости от характера и локализации патологического процесса.

Осознавая необходимость и востребованность надежных тест-систем для выявления анаэробной флоры, начиная с 2012 г. в ООО НПФ “Литех” ведутся работы над созданием соответствующих диагностических наборов. Поскольку среди анаэробов, выделяемых из клинического материала человека, представители рода Bacteroides spp. занимают лидирующие позиции, а их рутинная фенотипическая идентификация представляет собой весьма трудоемкий процесс с частыми ошибками, первыми на рынок диагностических услуг выпущены ПЦР тест-системы “БАКТО- ПОЛ” для обнаружения различных видов бактероидов, а также штаммов B. fragilis, продуцирующих энтеротоксин:

1.         Бактопол-1 (Bacteroides caccae);

2.          Бактопол-2 (Bacteroides distasonis, merdae);

3.          Бактопол-3 (Bacteroides eggerthii, stercoris, uniformis);

4.          Бактопол-4 (Bacteroides fragilis, vulgatus, thetaiotomicron, ovatus);

5.          Бактопол-токсин (Bacteroides fragilis toxin, BFT).

Наборы серии “БАКТОПОЛ” реализуют принцип обнаружения специфичных участков геномной ДНК бактероидов в реакции амплификации с гибридизацией с флуоресцентными зондами. Детекция продуктов ПЦР происходит в ходе реакции (в режиме реального времени) или после окончания процесса. Возможна электрофоретическая детекция. Биоматериалом для исследования может быть кал, урогенитальные соскобы, раневое отделяемое, мазки из зева и др. Применение наборов серии “БАКТОПОЛ” позволяет установить видовой состав бактерий рода Bacteroides в клинических образцах, а также дать оценку патогенного потенциала B. fragilis путем обнаружения генов продукции энтеротоксина.

На сегодняшний день к роду Bacteroides spp. относят 14 видов, 10 из которых принадлежат к группе B. fragilis: B. caccae, B. distasonis, B. eggerthii, B. fragilis, B. merdae, B. ovatus, B. stercoris, B. thetaiotaomicron, B. uniformis и B. vulgatus. Присутствуя в организме человека, бактероиды могут вызывать различные гнойно-воспалительные заболевания (перитонит, абсцессы, эндокардит, сепсис, тонзиллит, пародонтоз, поражения костей и суставов) после травм, оперативных вмешательств, инструментальных исследований, при онкопатологии или иммунодефиците. Бактероиды являются причиной заболеваний женских половых органов: цервицитов, эндометритов, инфекций малого таза. Обнаруживают бактероиды и у мужчин (примерно у 6,0% пациентов с осложненным постгонорейным уретритом) с хроническим течением заболевания и частыми рецидивами. У детей наличие бактероидов отмечено при перитонитах, остеомиелитах, целлюлитах, бактериемии. Бактероиды могут быть ассоциированы с болезнью Крона (B. vulgatus) и другими заболеваниями кишечника (B. fragilis, B. thetaiotaomicron и B. caccae). Смертность при бактериемии, вызванной Bacteroides, может составлять до 50,0% в зависимости от выявленного вида (В. thetaiotaomicron > B. distasonis > B. fragilis); и пока не ясно, связано ли это с различиями в факторах вирулентности или с антимикробной чувствительностью. Несомненно, уровень смертности может быть существенно снижен за счет своевременной диагностики инфицирования бактероидами и назначения этиотропной антимикробной терапии.

В патогенезе анаэробных инфекций важную роль играет воздействие бактериальных токсинов на ткани и органы человека. Изоляты B. fragilis, выделяемые, как правило, при сепсисе и желудочно-кишечных заболеваниях, продуцируют токсин - Bacteroides fragilis toxin (BFT), который является цинковой металлопротеазой с молекулярной массой 20 kDa. Энтеротоксигенные штаммы могут продуцировать три варианта (изотипа) энтеротоксинов, кодируемых генами bft-1, bft-2 и bft-3. Эн- теротоксигенные штаммы с высокой частотой выделяют также у пациентов с инфекциями легких, крови и при абсцессах. Энтеротоксин разрушает клеточные контакты между эпителиальными клетками и является потенциальной причиной диареи (до 10,0% случаев). Продуцирующие энтеротоксин изоляты B. fragilis обнаружены у детей младшего возраста (1-5 лет), страдающих диареей. Тем не менее некоторые клинические исследования свидетельствуют, что до 20,0% человеческой популяции являются асимптоматическими носителями энтеротоксигенных штаммов.

Лабораторная диагностика анаэробной инфекции в среднем занимает от 7 до 10 суток, что не может удовлетворять клиницистов. В последнее время накапливается все больше информации об успешном применении метода ПЦР для быстрого и качественного обнаружения ДНК бактерий рода Bacteroides по сравнению с традиционными способами идентификации анаэробных микроорганизмов. ПЦР-диагностика занимает всего несколько часов и отличается высокой чувствительностью и специфичностью. При изучении 400 образцов хирургической раневой инфекции методом количественной ПЦР в режиме реального времени (кРВ-ПЦР) Tong J. с соавт. в 132 образцах (33,0%) идентифицировали виды Bacteroides spp.. Методом культивирования бактероиды были обнаружены только в 31 образце (8,0%). Bacteroides uniformis был наиболее распространенным видом (44 положительных образца) по результатам кРВ-ПЦР, в то время как метод культивирования идентифицировал эту бактерию как B. fragilis (16 положительных образцов). Данное исследование подтвердило, что ПЦР является быстрым, специфичным и чувствительным методом, который имеет большой потенциал для выявления группы B. fragilis и родственных организмов в образцах хирургической раневой инфекции.

Liu C. и соавт. представили новую схему для идентификации 10 видов бактероидов из группы B. fragilis с помощью мультиплексной ПЦР. В результате были идентифицированы 155 изолятов этой группы, ранее определенных с помощью стандартных фенотипических тестов. Эффективность стандартных способов идентификации составила всего 84,5%.

Таким образом, мультиплексная ПЦР оказалась простым, быстрым и надежным методом для определения видов группы B. fragilis. Этот метод позволяет более точно определять роль представителей данной группы в развитии инфекций и степень их устойчивости к противомикробным препаратам.

Для обнаружения токсинов “золотым стандартом” в мире является исследование цитотоксического эффекта на различные клеточные линии, в случае B. fragilis - это линия HT-29. Наличие цитопатического эффекта (ЦПЭ) должно сравниваться с отрицательным контролем (фосфатно-солевой буфер или клеточная среда). Если ЦПЭ обнаружен, проводят нейтрализацию с антитоксином для подтверждения энтеротоксина, поскольку некоторые вирусы и бактерии также могут привести к возникновению ЦПЭ у клеточных линий. Недостатками этого метода являются его трудоемкость и большие временные затраты.

В течение последних 5 лет было разработано много способов на основе метода ПЦР для обнаружения токсина B. fragilis. Чувствительность и специфичность этих способов по сравнению с культивированием составляют около 91,0 и 100% соответственно, но эти значения могут быть немного меньше при работе с образцами кала из-за присутствия ингибиторов ПЦР.

В последние годы было отмечено повышение устойчивости к противомикробным препаратам для некоторых анаэробных бактерий, особенно для видов группы B. fragilis. Связанная с продукцией пеницил- лаз устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам среди анаэробов приближается к 100%, быстро растет резистентность к тетрациклинам;

резистентность к цефамицину (цефокситину), эритромицину и клиндамицину составляет около 12,0-30,0% во всем мире, что делает их непригодными для эмпирической терапии против Bacteroides. Интересно, что B. fragilis более восприимчив к антимикробным препаратам, чем другие виды Bacteroides. Bacteroides vulgatus наиболее устойчив к ампициллину- сульбактаму и пиперациллин-тазобактаму. Штаммы B. thetaiotaomicron/ ovatus показывают самый высокий уровень устойчивости к карбапене- мам с неизвестным механизмом резистентности. Bacteroides vulgatus резистентен к моксифлоксацину.

Учитывая устойчивость отдельных видов Bacteroides spp. к разным антибиотикам, при выборе адекватной антимикробной терапии желательно опираться на данные ПЦР-тестирования, охватывающего все разнообразие видов, ассоциированных с тяжелыми инфекциями человека.

Таким образом, обнаружение ДНК методом ПЦР имеет решающее значение для диагностики инфекций, вызванных представителями рода Bacteroides. Несмотря на тот факт, что роль анаэробных бактерий в патогенезе различных заболеваний человека подтверждена, качество лабораторной диагностики анаэробных инфекций остается спорным. Тем не менее выявление и изучение важных генов анаэробных бактерий с помощью молекулярно-генетических методов может привести к получению более точных данных об их патогенности и позволит избежать проблем, связанных с особыми условиями культивирования и крайне медленным ростом. Применение наборов серии “БАКТОПОЛ”, как дополнение к традиционному бактериологическому тестированию, позволяет существенно повысить результативность и информативность проводимых клинико-лабораторных исследований, что, в свою очередь, снизит риск возникновения осложнений и смерти при инфекциях, вызванных группой B. fragilis, а также будет способствовать назначению эффективной этиотропной терапии.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка
      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...







      Наши продукты






















      © 2006–2018 ООО «МЦФЭР», медиагруппа «Актион-МЦФЭР»

      Журнал «Здравоохранение» –
      практический журнал для главного врача.

      Все права защищены. Полное или частичное копирование любых материалов сайта возможно только с письменного разрешения редакции журнала «Здравоохранение».
      Нарушение авторских прав влечет за собой ответственность в соответствии с законодательством РФ.

      Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
      Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Когда вы посещаете страницы сайта, мы обрабатываем ваши данные и можем передать сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать документ на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 12 000 статей
      — 8 000 ответов на вопросы
      — 200 видеосеминаров
      — готовые формы и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные сервисы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×