Секвенирование экзома: технология и применение в клинико-диагностических целях

105

Завершение в 2000 г. программы “Геном человека” совершило революцию в медицине и ознаменовало становление новой науки - предиктивной медицины.

“Геном человека” - международный научно-исследовательский проект, конечной целью которого было определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также выявление генов и их локализации. Ген — структурная и функциональная единица генома, контролирующая развитие определенного признака организма. Изменение гена приводит к изменению признака, контролируемого этим геном. В результате секвенирования большинства функционально значимых генов были выявлены структурные изменения, влияющие на риск развития некоторых заболеваний. Большинство таких изменений представляют собой явление генетического полиморфизма, выражающееся либо в замене одного нуклеотида (SNP), либо в удалениях или дополнительных вставках небольших фрагментов ДНК (инсер- ции/делеции). Наиболее распространенный в популяции вариант гена является нормой, редкие формы в той или иной степени повышают или понижают риск развития определенных заболеваний у носителя такого генотипа. Возможность оценки индивидуального риска развития заболевания положила начало многочисленным исследованиям, посвященным разработке молекулярно-генетических тестов. В декабре 2003 г. управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) впервые одобрило применение наборов реагентов для обнаружения генов (генетических тестов), которые предназначены для выявления лиц группы риска с наследственной предрасположенностью к тромбозу. В ноябре 2004 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) утвердила первый международный стандарт выполнения генетических тестов.

Сегодня практически все диагностические лаборатории в Европе предлагают различные генетические тесты, оценивающие индивидуальный риск развития более 100 многофакторных заболеваний.

Каждый желающий может пройти генетическое тестирование и получить данные о том, какие заболевания и с какой вероятностью могут развиться у него в течение жизни. Это позволит еще до появления первых симптомов болезни принять все профилактические меры и сохранить здоровье.

Другой не менее многообещающий результат проекта “Геном человека” - становление и развитие фармакогенетики. В результате многочисленных ассоциативных исследований было показано, что некоторые редкие варианты генов могут обусловливать различные индивидуальные реакции на лекарственные средства и значительно влиять на успешность терапии и проявление побочных эффектов. Так, перед применением кодеина рекомендуется молекулярно-генетический анализ вариантов генов CYP 2D6, т. к. у носителей редкой формы этого гена происходит изменение метаболизма препарата с накоплением токсических веществ. Фармакогенетика позволяет подобрать наиболее эффективный препарат и его дозу. Сегодня перед применением более 70 лекарственных средств рекомендуется выполнить молекулярно-генетический анализ соответствующих генов, участвующих в метаболизме препарата.

Ранее основным методом выполнения молекулярно-генетических тестов являлось проведение амплификации определенных фрагментов ДНК с дальнейшим капиллярным электрофорезом для определения последовательности амплифицированного фрагмента. Этот подход эффективен в тех случаях, когда генетический локус, влияющий на развитие того или иного заболевания, заранее известен. Недостаток метода заключается в том, что с помощью него достаточно сложно выявить те случаи, когда причина физиологических нарушений лежит в нескольких генах (генетическая гетерогенность заболевания). Кроме того, если заранее неизвестно, какой ген может быть вовлечен в патогенез заболевания, или если стоит задача проверить влияние всех генов на возможное участие в патогенезе заболевания, лучше определять последовательность ДНК, не ограничиваясь одним генетическим локусом. Целиком последовательность генома можно определить, используя полногеномное секвенирова- ние (whole genome sequencing). Однако этот метод весьма затратен с финансовой точки зрения и занимает большое количество времени. Кроме того, для многих задач не имеет смысла читать весь геном, важно определить белок-кодирующие последовательности.

Поэтому в настоящее время значительно более перспективным направлением выполнения молекулярно-генетических тестов является полное определение последовательности экзома - белок-кодирующей части генома. Метод секвенирования экзома значительно выигрывает перед полногеномным секвенированием, т. к. экзоны занимают всего 1% от генома, но именно в их структуре происходит 85% всех изменений, ассоциированных с развитием заболеваний и другими физиологическими изменениями. Кроме того, с помощью секвенирования экзома намного легче произвести “глубокое покрытие” (прочтение одного и того же образца большое количество раз), что позволяет с высокой точностью определять те или иные мутации. Дополнительно следует отметить, что секвенирование экзома включает в себя и определение последовательности сайтов сплайсингов, это чрезвычайно важно для понимания патогенеза заболевания, поскольку сайты сплайсинги обладают высокой функциональной вариабельностью.

По мнению мирового сообщества врачей-генетиков и исследователей, в ближайшем будущем именно секвенирование экзома станет золотым стандартом выполнения молекулярно-генетических тестов.

Потенциальное применение секвенирования экзома

Что же такое экзом? По современным представлениям, экзом составляют более 160 тыс. кодирующих экзонов, включая канонические сайты сплайсинга и miRNA кодирующие последовательности. Общая длина всего экзома составляет около 30 млн пар нуклеотидов. Секвенирование экзома позволяет определить полный индивидуальный генотип человека, включающий все известные полиморфизмы и редкие мутации. Более детальное описание индивидуального генотипа вряд ли когда-либо станет возможным и прогностически значимым. В результате секвенирования экзома будет сформирован т. н. “генетический паспорт”, содержащий информацию, перспективную как минимум для следующих приложений. В первую очередь в генетическом паспорте будет дана количественная оценка наследственного риска развития некоторых заболеваний, необходимая для реализации эффективной профилактики, ранней диагностики и персонализации тактики терапии. Помимо вероятности развития заболеваний у самого носителя генотипа, в генетическом паспорте будет содержаться информация о риске рождения ребенка с тяжелым наследственным заболеванием. Такая информация актуальна при планировании ребенка в семьях, где оба родителя являются носителями вариантов генов, приводящих к развитию наследственных заболеваний. Эти два приложения обладают огромным потенциалом для человека с точки зрения сохранения здоровья. Кроме этого на основании генетического паспорта может быть установлено отцовство, родство и идентифицирована личность. В будущем, при накоплении достаточных данных, будут открыты неизвестные сегодня изменения в геноме, ассоциированные с заболеваниями или другими физиологическими нарушениями. Чем большим числом последовательностей экзомов будут располагать исследователи, тем вероятнее новые значительные открытия.

Каким образом осуществляется секвенирование экзома?

Секвенирование экзома осуществляется с помощью технологии “сек- венирования второго поколения”, также называемой “секвенирование следующего поколения” (next generation sequencing - NGS). Самыми известными платформами для NGS-секвенирования являются Roche 454, Illumina Genome Analyzer (GA) и Applied Bio-systems (ABI) SOLiD. NGS- платформы позволяют генерировать от сотен мегабаз до сотен гигабаз нуклеотидных последовательностей за один запуск прибора, в зависимости от конкретной платформы.

Все разработанные платформы основаны на принципе циклического микроэррейного секвенирования (cyclic array sequencing). Основное преимущество такого подхода очевидно, метод позволяет одновременно параллельно анализировать миллионы или даже биллионы фрагментов ДНК. Расход реагентов на ячейку (кластер) составляет всего несколько пиколитров, что обеспечивает экономичный расход реагентов (микролитры). Платформы для NGS-секвенирования достигают беспрецендентно низкой стоимости за счет параллельного декодирования двухмерного эр- рея, несущего миллионы уникальных “кластеров” фрагментов ДНК. Различные платформы отличаются способом генерации кластеров, биохимическими методами секвенирования, методами детекции. Возможность использования NGS-технологии в клинических целях появилась благодаря быстрому падению стоимости секвенирования.

Цена полного секвенирования генома сократилась с более чем 50 000 долл. в 2009 г. до менее чем 5000 долл. в 2011 г. Ожидается, что полное секвенирование генома скоро будет стоить менее чем 1000 долл. Стоимость секвенирования экзома уже на сегодняшний день составляет около 1500 долл.

Непосредственно процессу “считывания” последовательности предшествует длительный процесс пробоподготовки. На первом этапе пробоподготовки ДНК подвергается случайному расщеплению с помощью ультразвука или гидродинамического воздействия на фрагменты размером 300-500 пар оснований. Затем к каждому фрагменту с двух сторон пришиваются специальные олигонуклеотиды с известной последовательностью, называемые адапторами. В составе адапторов находится прай- мерная последовательность, необходимая для амплификации ДНК. Порезанная ДНК, расширенная адапторами, называется ДНК-библиотекой. ДНК-библиотека в случае секвенирования экзома состоит исключительно из тех регионов ДНК, которые изначально интересуют исследователя. Селекция нужных участков осуществляется специальным образом, направленным на получение образцов ДНК, состоящих из белок-кодирую- щих и регуляторных областей генома (т. н. захват экзома). Существует несколько способов селекции интересующих исследователя участков.

Гибридизационный способ

Селекция данным способом осуществляется с помощью олигонуклеотидов, комплементарных по своей последовательности интересующим участкам генома. Размер используемых олигонуклеотидов варьируется от 60 до 180 нуклеотидов. Путем гибридизации этих олигонуклеотидов с фрагментами ДНК осуществляется изоляция нужных исследователю регионов. Те участки ДНК, которые не гибридизовались с олигонуклеотидами, отмываются. Селекция при помощи гибридизации обычно осуществляется двумя способами - в растворе или на твердом носителе. Данный подход превосходит все другие известные методы селекции экзома по размеру участка, который можно “захватить” этим методом (10-50 мегабаз). Эта особенность полезна, если целью исследования является секвенирование всего экзома или большого количества генов. Гибридизационный метод может найти применение в онкологии, где необходимо знать последовательность около 100-1000 генов.

Селекция с помощью молекулярных инвертированных проб

Молекулярные инвертированные пробы (МИП) представляют собой олигонуклеотиды, в середине которых находится универсальная последовательность, а на концах - последовательность, комплементарная (и инвертированная) концам интересующих участков генома. После гибридизации МИП с нужными участками, происходит полимеризация “бреши” между концами МИП и реакция лигирования для образования кольцевой структуры. МИП, которые не вступают в реакцию гибридизации с ДНК, остаются линейными и удаляются при помощи экзонуклеаз.

Существует еще один способ селекции экзомов при помощи МИП. ДНК подвергается расщеплению с помощью специального набора рестриктаз. МИП гибридизуются с концевыми последовательностями участков, подвергшимися рестрикции. Таким образом, 3’ и 5’ концы вырезанных участков оказываются расположенными рядом друг с другом, благодаря чему становится возможной реакция полимеризации. После полимеризации “бреши” и реакции лигирования, образуются замкнутые кольцевые структуры.

Этот подход существенно отличается от гибридизационного метода селекции экзома. В частности, рассмотренный метод выигрывает перед гибридизационным методом с точки зрения специфичности, однако проигрывает с точки зрения выхода продукта. Поэтому используется этот подход в том случае, когда нужно подвергнуть селекции ограниченное количество участков ДНК из большого объема образцов. Средний размер участка, который можно “захватить” этим методом, составляет 0,5-1 мегабаз.

Селекция с помощью полимеразной цепной реакции

Селекция с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее простым методом “захвата” нужных участков ДНК с точки зрения методологии. Основное преимущество метода заключается в том, что с его помощью можно не только провести селекцию, но и увеличить количество копий нужного фрагмента. Это особенно актуально в тех случаях, когда количество ДНК изначально мало. Недостатком метода является то, что он неприменим в случае необходимости амплификации участков большой длины.

Чаще всего для этого типа селекции используют ПЦР длинных фрагментов (long-range PCR). Многие производители предлагают различные наборы реагентов, позволяющие амплифицировать фрагменты размером до 20 килобаз. Альтернативным способом осуществления селекции является проведение мультиплексной ПЦР, в результате которой происходит одновременная амплификация нескольких последовательностей ДНК в одной реакционной смеси.

Еще одним интересным методом селекции экзомов является технология микрокапельной ПЦР (micro-droplet PCR), которая позволяет проводить амплификацию большого количества участков ДНК одновременно. При этом амплификация каждого конкретного региона пространственно отделена от других путем изолирования в капле воды.

Методы селекции экзомов с помощью МИП и ПЦР больше подходят для тех задач, где необходимо определить последовательность лишь нескольких генов.

Интерпретация результатов экзомного секвенирования

При интерпретации результатов экзомного секвенирования важно помнить, что этот метод позволяет определить те аллельные варианты, которые влияют на функцию белка. Экзомное секвенирование не может определить замены в некодирующих областях генома (области, которые не покрывает секвенирование экзома, составляют 99%).

Для установления новых генетических вариантов, вовлеченных в формирование заболевания, используется ступенчатый подход к фильтрации большого количества данных, полученных в результате секвени- рования экзома. Сначала фиксируются все аллельные варианты, которые можно обнаружить с помощью данного метода (включая несинонимические замены и замены в сайтах сплайсинга). Затем проводится сравнение полученных результатов с экзомным секвенированием контрольных образцов и с базами данных по генетическим полиморфизмам (таких как dbSNP). Путем этих сравнений исключаются аллельные варианты, не влияющие на развитие заболевания. В результате такой фильтрации изначальный список генов, претендующих на роль генов-кандидатов, значительно сужается.

Непростой задачей после проведения секвенирования генома является статистический анализ большого количества данных. Особенно серьезной следует считать проблему получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для ее решения и улучшения качества интерпретации результатов секвенирования экзомов было предложено несколько путей:

  • сравнение результатов экзомного секвенирования с результатами ге- нотипирования на чипах;
  • сравнение полученных результатов с референсными последовательностями, полученными с помощью секвенирования методом Сенгера;
  • сравнение полученных результатов с референсными последовательностями, полученными с помощью полноэкзомного секвенирования.

Опыт применения секвенирования экзомов в клинике

Выявление генетических дефектов, лежащих в основе моногенных заболеваний, - одно из наиболее очевидных применений метода секвенирования экзома. Эта группа заболеваний патогенетически и этиологически обусловлена мутациями в одном гене, повреждение которого имеет определяющее значение для эффекта развития болезни. Наследование моногенных заболеваний идет в соответствии с законами Менделя, поэтому они называются менделирующими заболеваниями, по имени выдающегося исследователя-генетика Грегора Менделя.

К настоящему времени описано более 3 тыс. менделирующих заболеваний человека. В связи с постоянными спонтанными мутациями новые патогенетические аллели появляются каждый год. Количество известных мутаций в геноме человека сегодня превышает 100 тыс. в более чем 3700 генах (Human Gene Mutation Database). Однако можно быть уверенными, что это лишь малая фракция клинически релевантных аллелей генома.

Секвенирование экзомов открывает новую эру в диагностике моногенных заболеваний. Классический путь подразумевал анализ сцепления в семьях, отягощенных по исследуемому моногенному заболеванию, идентификацию кандидатного хромосомного района, постепенное его сужение и, наконец, полное секвенирование кандидатных генов, попадающих в подозрительный район хромосомы. Однако этот путь дорого стоил в прямом и переносном смысле слова, а успех идентификации патогенетических аллелей был весьма ограничен из-за малого количества пациентов с исследуемой болезнью, а также ввиду часто достаточно высокой генетической гетерогенности кандидатного локуса.

Кодирующие белки гены представляют собой около 1% генома человека, но несут 85% “сильных” высокопенетрантных мутаций, ассоциированных с заболеваниями человека. В то же время абсолютное большинство менделирующих заболеваний вызывается именно мутациями в экзонах и их сайтах сплайсинга.

Таким образом, можно считать, что секвенирование экзома является диагностическим методом. При обеспечении достаточного его покрытия при прочтении (более 30-кратного, это около 1 GB нуклеотидных пар) мы можем детектировать большинство гомозиготных и гетерозиготных аллельных вариантов, которые несет данный индивид в кодирующей части экзома. В данном случае успех будет зависеть от способности определить именно патогенетический аллель заболевания на фоне большого количества новых аллелей, характерных для каждого индивидуального экзома.

Стратегия выявления таких аллелей лежит на нескольких базовых допущениях. Во-первых, гомозиготные или гетерозиготные мутации в одном гене достаточны, чтобы вызвать заболевание, и эти мутации исключительно редки (присутствуют только у больных). Во-вторых, в силу высокой пенентрантности они должны иметь выраженное влияние на структуру и функцию белка, кодируемого этим геном (несинонимичные замены, делеции, инсерции, мутации в канонических последовательностях сайтов сплайсинга).

Еще одним применением секвенирования экзома является выявление мягких форм моногенных заболеваний, обусловливающих нарушения обмена веществ. При осуществлении неонатального скрининга может быть проведено выявление моногенных заболеваний на ранней стадии и вовремя назначена диета, предотвращающая последствия развития моногенных заболеваний обмена веществ.

Клиническую значимость секвенирования экзома продемонстрировала работа Choi et al., 2009. Этот подход позволил поставить неожиданный диагноз “хлоридная врожденная диарея” пациенту с первоначальным диагнозом “неонатальный синдром Барттера” (a renal salt-wasting disease). Синдром Барттера наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Молекулярный диагноз базировался на находке гомозиготной миссенс мутации в гене SLC26A3 (известный локус для хлоридной врожденной диареи). Еще пять пациентов с синдромом Барттера, но не имеющие мутаций в известных генах, имели гомозиготные патогенные мутации в гене SLC26A3.

Интерес к применению секвенирования экзомов для заболеваний, не являющихся менделирующими, возрастает. Уже найдены новые мутации, вызывающие развитие многофакторных заболеваний (в гене APOE при болезни Альцгеймера, гене CFH при возрастной макулярной дегенерации, и гене GBA/LRRK2 при болезни Паркинсона). Для эпилепсии метод секвенирования экзомов позволил выявить аллельные варианты, увеличивающие риск заболевания, и даже создать модель прогнозирования.

Секвенирование экзома также доказало свою ценность для многих неврологических заболеваний - для них существует большой список генов- кандидатов и локусов, поэтому зачастую дешевле и быстрее найти мутации с помощью секвенирования экзомов. Кроме того, с помощью экзомного секве- нирования были обнаружены новые мутации для данного типа заболеваний (мутация в гене TECR для несиндромной умственной отсталости, мутация в гене WDR62 для тяжелых пороков развития мозга, мутации в гене TGM6 для атаксии и мутации в гене WRN для атипичного синдрома Вернера).

Для многих заболеваний с высокой степенью генетической гетерогенности цель скрининга часто состоит в выявлении наиболее распространенных мутаций или изменений в наиболее часто мутирующих генах. Montenegro и его коллеги  продемонстрировали значение сек- венирования при анализе данных семьи с заболеванием “наследственная невральная амиотрофия”. Они просеквенировали 35 генов, которые вызывают эту болезнь, у двух болеющих членов семьи. Благодаря этому исследователи идентифицировали новые мутации в GJB1 гене, которые и являлись причиной развития данного заболевания.

Двадцать девятого сентября 2011 г. Ambry Genetics добавили услугу “клиническая диагностика экзома”, став первой CLIA-сертифицированной лабораторией, предложившей услугу секвенирования экзома вместе с медицинской интерпретацией для клинико-диагностических целей. Эта услуга предоставляется прежде всего тем пациентам, которым не смогли поставить диагноз традиционными методами, либо тем, у кого поставленный диагноз не являлся однозначным. Услуга включает в себя секве- нирование наиболее важных регионов генома (около 20 тыс. генов), для которых установлено, что они оказывают влияние на развитие заболеваний. Ambry Genetics не только проводит секвенирование, но и предоставляет услуги по интерпретации более 50 мегабаз последовательности.

Определение основных мутаций, являющихся причиной заболеваний, имеет серьезные последствия для диагностических и терапевтических подходов, может прогнозировать развитие болезни, дает возможность проверить риск подверженности заболеваниям людям с семейными формами болезней. Множество факторов обусловливают преимущества секвенирования экзомов перед анализом одного гена, в т. ч. в возможности выявление мутаций в генах, которые могут влиять на атипичную картину течения заболевания. Кроме того, секвенирование экзомов помогает определить клиническое течение заболевания и правильно поставить диагноз.

Словарь терминов:

  1. SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм.
  2. Экзон - участок ДНК, который является частью гена и содержит информацию о последовательности аминокислот белка.
  3. Сайты сплайсинга - последовательности, по которым происходит процесс вырезания интронов из молекулы РНК.
  4. miRNA - класс некодирующих РНК, играющих важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК.
  5. dbSNP (database SNP) - база данных однонуклеотидных полиморфизмов.
  6. Миссенс мутации - точечные мутации, в результате которых измененный кодон начинает кодировать другую аминокислоту.

CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) - регулируемые правительством США стандарты, которые распространяются на все существующие лаборатории в стране, чья деятельность связана с тестированием людей. Аккредитация CLIA дает повышенную гарантию на точность, своевременность и надежность результатов лабораторий.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка
      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...







      Наши продукты






















      © 2006–2018 ООО «МЦФЭР», медиагруппа «Актион-МЦФЭР»

      Журнал «Здравоохранение» –
      практический журнал для главного врача.

      Все права защищены. Полное или частичное копирование любых материалов сайта возможно только с письменного разрешения редакции журнала «Здравоохранение».
      Нарушение авторских прав влечет за собой ответственность в соответствии с законодательством РФ.

      Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
      Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать документ на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 12 000 статей
      — 8 000 ответов на вопросы
      — 200 видеосеминаров
      — готовые формы и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные сервисы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×