Проект стандартизованной технологии «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis)»

43

1. Цель исследования.

Настоящая стандартизованная технология устанавливает единые требования к выполнению исследования по выявлению нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis в биологическом материале с применением молекулярно-биологических методов в клинико-диагностических и микробиологических лабораториях медицинских организаций.

Выявление нуклеиновых кислот (далее - НК) возбудителей в биологическом материале с использованием молекулярно-биологических методов является одним из наиболее чувствительных и специфичных способов, применяемых в клинической лабораторной диагностике, который позволяет оценить наличие/отсутствие возбудителя и проводить оценку эффективности терапии.

2. Требования к обеспечению выполнения технологии

·  Требования к специалистам и вспомогательному персоналу

Исследование «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)» имеют право проводить врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, биологи, прошедшие специализацию и периодическое повышение квалификации в установленном порядке. Указанные специалисты должны иметь удостоверение о краткосрочном повышении квалификации на лицензированных курсах «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» или аналогичных.

Врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, биологи осуществляют контроль всего технологического процесса и принимают решение о необходимости дополнительных исследований (повторное проведение измерения, и т. п.). Врачи клинической лабораторной диагностики консультируют врачей-дерматовенерологов, врачей-гинеко- логов, врачей-урологов, а также врачей других специальностей, занимающихся вопросами инфекционной патологии, вызванной данными возбудителями, и помогают в интерпретации результатов исследований.

Врач клинической лабораторной диагностики (врач-бактериолог, биолог) должен знать:

  • показания к назначению исследования, критерии оценки результатов;
  • все этапы подготовительной работы и проведения исследования: правила взятия биологического материала, правила техники безопасности при работе с потенциально инфицированным биологическим материалом, требования к доставке и хранению материала, методики проведения исследования.

Должен уметь:

провести исследование, обработать результаты.

Подготовительную работу выполняет специалист со средним медицинским образованием и соответствующей квалификацией (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант,

лаборант), имеющий сертификат специалиста и прошедший периодическое повышение квалификации в установленном порядке.

Персонал со средним медицинским образованием проводит: прием поступающих в лабораторию образцов и сопроводительных документов, регистрацию полученного биологического материала, проведение технических манипуляций, не требующих высокой квалификации: подготовка помещений, ламинарных боксов, расходных материалов, утилизация использованных расходных материалов и остатков использованных биологических образцов.

·  Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала

Исследования «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)» выполняются в организациях, имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданное в установленном порядке.

Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы, молекулярно-биологическими методами связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к медицинской организации при проведении данных работ с целью предотвращения контаминации НК и/или ампликонами исследуемых проб, помещений, оборудования. Лица, отвечающие за сбор, доставку и анализ образцов биологического материала, должны руководствоваться правилами техники безопасности при работе с ними. Все образцы биологического материала считают потенциально опасными, т. к. они могут содержать патогенные микроорганизмы.

Противоэпидемический режим работы лаборатории, выполняющей исследования «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)», должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.2322-08, регламентирующими работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

Персонал, непосредственно участвующий в проведении анализа «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)», обязан соблюдать общие правила работы в молекулярно-биологических лабораториях (МУ 1.3.2569-09), строго придерживаться общих стандартов по формированию и поддержанию безопасности рабочей среды в медицинских лабораториях при манипуляциях с пробами пациентов, химическими реактивами и другими объектами потенциальной опасности для здоровья людей (ГОСТ Р 52905-2007).

Организация помещений, требования к оборудованию и правила работы в лаборатории, выполняющей исследования по выявлению ДНК или РНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis, должны соответствовать требованиям, изложенным в МУ 1.3.2569-09.

Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам, используемым в технологии (амплификаторы, центрифуги, термостаты и др.); персонал, работающий с реактивами, должен быть обучен обращению с ними, использовать средства персональной защиты, соблюдать правила личной гигиены.

Для предупреждения пожара необходимо соблюдать правила пожарной безопасности в соответствии с действующими нормативными документами.

Сбор, временное хранение, обеззараживание и транспортировка потенциально опасных отходов, загрязненных остатками биологического материала, образующихся в процессе выполнения технологии, должны проводиться в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами (СанПиН 2.1.7.2790-10). Отходы, содержащие (потенциально содержащие) микроорганизмы (материалы и инструменты, предметы, загрязненные кровью и/или другими биологическими жидкостями), - отходы класса Б, - подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции)/обезвреживанию. Выбор метода обеззараживания/обезвреживания определяется возможностями организации, осуществляющей медицинскую деятельность. Отходы класса Б собираются в одноразовую мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) желтого цвета или имеющую желтую маркировку. Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов.

Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии

Лабораторное оборудование

Все электрические устройства и приборы должны быть зарегистрированы на территории РФ, иметь сертификат соответствия ГОСТ Р Госстандарта России и отвечать требованиям соответствующих нормативных документов, что позволяет предотвратить их взрыво- и пожароопасность.

Оснащение отдельных рабочих зон производится в соответствии с нижеприведенными перечнями.

Зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала: набор автоматических пипеток переменного объема;

1. одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл;

2. одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром объемом до 200 мкл и до 1000 мкл;

3. штативы для наконечников и микропробирок объемом 1,5-2,0 мл;

4. комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 16 °С;

5. емкость с регламентируемым дезинфицирующим раствором;

6. емкость с 70,0% этиловым спиртом;

7. емкость для сброса отработанных расходных материалов.

Зона выделения нуклеиновых кислот из образцов биологического материала:

1.      бокс биологической безопасности II или III класса биологической защиты; твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25-100 °С;

2. настольная центрифуга для микропробирок объемом 1,5-2,0 мл, до 10 000 g;

3. микроцентрифуга/встряхиватель;

4. вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;

5. набор автоматических пипеток переменного объема;

6. одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5-2,0 мл;

7. штативы для микропробирок объемом 1,5-2,0 мл и наконечников;

8. одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 и 1000 мкл с фильтром;

9.      одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл; холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 16 °С (для хранения наборов, предназначенных для выделения НК);

10.   комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 16 °С для хранения препаратов НК (не допускается хранение препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК!);

  • емкость с дезинфицирующим раствором;
  • емкость для сброса отработанных расходных материалов.

С целью автоматизации процедуры выделения НК допускается использование автоматизированного оборудования.

Зона проведения реакции обратной транскрипции и этапа амплификации:

  • программируемый амплификатор с флуоресцентным ПЦР- детектором, либо программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени»;
  • бокс биологической безопасности II и III класса или настольный бокс с бактерицидной лампой (ПЦР-бокс; УФ-бокс);
  • микроцентрифуга/встряхиватель;
  • набор автоматических пипеток переменного объема;
  • штативы для микропробирок объемом 0,5 (0,2) мл и наконечников;
  • одноразовые полипропиленовые микропробирки для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 0,5 (0,2; 0,1) мл;
  • одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10 мкл, 100 мкл и 200 мкл, свободные от ДНКаз и РНКаз;
  • комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 0С и не выше минус 16 0С (для хранения наборов, предназначенных для проведения амплификации НК);
  • емкость для сброса отработанных расходных материалов.

С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования для раскапывания реагентов.

Реактивы

Для проведения исследования «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)» могут быть использованы только наборы реагентов, зарегистрированные на территории РФ в установленном порядке. Наборы реагентов должны содержать инструкцию на русском языке, описывающую все этапы исследования.

Набор реагентов должен содержать все реагенты, необходимые для проведения всех этапов исследования.

Прочий расходуемый материал Одноразовые перчатки для работы.

Характеристика методик выполнения технологии

· Получение образцов биологического материала

Взятие биологического материала следует осуществлять одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры. Работы выполняются в одноразовых перчатках.

Использовать пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой - производителем наборов реагентов (в случаях, где использование транспортной среды предусмотрено инструкцией к набору реагентов). Недопустимо использование транспортной среды других фирм- производителей, если это противоречит инструкции к набору реагентов.

Сразу после взятия следует плотно закрывать пробирки, флаконы с биологическим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.

При переносе биологического материала из пробирок, флаконов использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами.

При работе с биологическим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, это может привести к контаминации биологического материала и рабочих поверхностей.

Строго соблюдать правила хранения и транспортирования биологического материала. Охлаждающие элементы перед транспортированием биологического материала замораживать до необходимой температуры.

Таблица 1

Виды биологического материала для выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем

Вид биологического материала

Возбудитель

1

2

Соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта

N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis

Соскобное отделяемое слизистой ротоглотки

N. gonorrhoeae

Отделяемое конъюнктивы глаз

N. gonorrhoeae, C. trachomatis

Моча

N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis

Секрет предстательной железы

N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis

Получение образцов мочи

Для молекулярно-биологических исследований следует собирать первую порцию утренней мочи в количестве 20,0-30,0 мл в специальный сухой стерильный флакон объемом 50,0 мл.

Условия хранения материала:

образец мочи следует доставить в лабораторию в течение 6 ч после взятия; при невозможности доставки в указанные сроки - разрешается хранить образец при температуре 2-8 °С в течение 24 ч с момента получения. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Получение образцов биологического материала из ротоглотки

Отделяемое следует забирать сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе, вращательными движениями, с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После получения материала рабочую часть зонда поместить в пробирку объемом 2,0 мл с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, аккуратно обломить пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части и оставить рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среде).

Получение образцов отделяемого конъюнктивы глаз

Материал следует получать сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой основе под местной анестезией (2 капли раствора декаина). Оттянув нижнее веко, вращательными движениями провести тампон 4-5 раз по конъюнктиве, захватывая внешний и внутренний углы глаза. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) поместить в пробирку объемом 2,0 мл с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, аккуратно обломить пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части или в области насечки и оставить рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среде).

Получение образцов из урогенитального тракта женщин

Получение образцов соскоба эпителия из цервикального канала

Получение материала производить с помощью цервикальной цитощетки в пробирку объемом 2,0 мл с транспортной средой.

Удалить слизь с поверхности шейки матки стерильным тампоном, ввести рабочую часть цитощетки в цервикальный канал и сделать два полных оборота по часовой и против часовой стрелки. Извлечь зонд, избегая касания стенок влагалища, и поместить его в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть цитощетки, содержащую исследуемый материал, обломить в области насечки и оставить в пробирке с транспортной средой.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среде).

Получение образцов отделяемого влагалища

Получение материала следует производить с помощью универсального зонда в пробирку объемом 2,0 мл с транспортной средой.

Ввести рабочую часть зонда в область задненижнего свода влагалища и, вращая зонд, провести по поверхности эпителия, максимально полно набрать материал на зонд. Перенести зонд в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть зонда, содержащую исследуемый материал, обломить в области насечки и оставить в пробирке с транспортной средой. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среде).

Получение образцов отделяемого уретры женщин. Соскоб эпителиальных клеток из уретры женщин

Получение отделяемого уретры следует производить с помощью уретрального зонда в пробирку объемом 2,0 мл с транспортной средой. Допустимо присутствие примесей в виде слизи и крови.

Перед взятием соскоба из уретры необходимо обработать наружное отверстие уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить отделяемое из влагалища. Ввести рабочую часть зонда в уретру, несколькими вращательными движениями собрать отделяемое уретры на рабочую часть зонда и перенести зонд в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть зонда, содержащую исследуемый материал, обломить в области насечки и оставить в пробирке с транспортной средой. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среде).

Получение образцов из урогенитального тракта мужчин

Получение образцов отделяемого уретры мужчин. Соскоб эпителиальных клеток из уретры мужчин

Перед взятием соскоба из уретры необходимо обработать головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Произвести массаж уретры. При наличии свободно стекающих из уретры выделений удалить их сухим тампоном. Ввести зонд в уретру на глубину 1-2 см. Несколькими вращательными движениями произвести соскоб эпителиальных клеток и перенести зонд в пробирку с транспортной средой. Затем рабочую часть зонда, содержащую исследуемый материал, обломить в области насечки и оставить в пробирке с транспортной средой. Пробирку плотно закрыть, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать. Допустимо присутствие примесей в виде слизи, крови и гноя.

Условия хранения материала: согласно инструкции к рекомендуемой среде для транспортировки биологического материала (транспортной среды).

Получение образцов секрета предстательной железы

Перед получением секрета простаты головку полового члена обработать стерильным ватным тампоном. Секрет простаты следует собирать после предварительного массажа простаты через прямую кишку. Врач проводит массаж с надавливанием несколькими энергичными движениями от основания к верхушке. После окончания массажа предстательной железы ее секрет в количестве 0,5-1,0 мл собрать в одноразовую стерильную сухую пробирку объемом 2,0 мл. Пробирку плотно закрыть крыш-

кой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать. При невозможности получить секрет - сразу после массажа простаты - следует собрать первую порцию мочи (в которой содержится секрет предстательной железы) в количестве 20,0-30,0 мл (см. правила получения мочи).

Условия хранения:

материала: образец секрета предстательной железы следует доставить в лабораторию в течение 6 ч после взятия. При невозможности доставки в лабораторию в указанные сроки, разрешается хранить образец при температуре 2-8 °С в течение 24 ч с момента взятия. При температуре минус 20 °С образец хранится в течение 1 недели. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Идентификация образца

В направление на исследование должна быть включена следующая информация: фамилия и инициалы (код) пациента, возраст или дата рождения, пол, у женщин - день менструального цикла или срок беременности (недель), дата и время получения образца, вид биологического материала (например, моча, вагинальное отделяемое и др.), предварительный клинический диагноз, фамилия и инициалы врача, назначившего исследование.

Приемлемость образца

После доставки образца в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на исследование, маркировку посуды (код или фамилия больного и другие данные должны быть идентичны данным, указанным в бланке направления), ее целостность и зарегистрировать поступивший материал в рабочем журнале в бумажной или электронной форме. Нумерация образцов при их регистрации должна быть сквозной. Непригодными для исследования являются образцы:

  • немаркированные или имеющие неверную маркировку;
  • для которых не указаны дата и время сбора материала;
  • собранные ранее 24 ч от момента доставки в лабораторию (для образцов мочи и секрета предстательной железы);
  • при нарушении целостности и/или герметичности посуды (в т. ч. пролитые образцы).

В случае непригодности доставленного образца необходимо уведомить врача, назначившего исследование, и рекомендовать повторное взятие материала с соблюдением всех перечисленных правил.

Если повторное взятие таких образцов материала невозможно, при оформлении результата молекулярно-биологического исследования необходимо отразить возможность влияния нарушения правил преаналитического этапа на полученный результат.

Описание хода выполнения данной стандартизованной технологии

Выявление ДНК или РНК возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis) должно проводиться с использованием наборов реагентов, которые прошли государственную регистрацию в установленном порядке и разрешены к применению на территории РФ.

При проведении исследования нельзя использовать реагенты из наборов реагентов разных производителей, если это не оговорено в инструкциях к наборам!

Стандартизованная технология состоит из трех основных этапов:

  • выделение и очистка ДНК или РНК;
  • реакция амплификации с детекцией продуктов;
  • анализ и обработка результатов с помощью компьютерных программ.

Все этапы технологии должны выполняться в строгом соответствии с инструкцией к наборам реагентов.

Описание стандартных операционных процедур

Принцип метода

Для выявления НК возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis) используются молекулярно-биологические методы: метод амплификации ДНК на основе ПЦР с электрофоретической

(ПЦР-ЭФ) или гибридизационно-флуоресцентной детекцией (по конечной точке - ПЦР-КТ или в режиме реального времени - ПЦР-РВ); метод амплификации РНК на основе обратной транскрипции НА-

СБА (NASBA - Nucleic acid sequence-based amplification).

Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Первым этапом анализа при использовании каждого из названных методов для выявления возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis ) является выделение и очистка (НК) из образца биологического материала. Для этого используют реагенты, входящие в состав соответствующего набора. Стандартные этапы выделения и очистки НК состоят из лизиса с использованием хаотропных солей (например, гуанидинтиоционата), очистки НК от белков, полисахаридов и др., сорбции НК на частицах или преципитации на дно пробирки, элюции НК в буфере. Для этапа выделения и очистки НК могут быть использованы автоматизированные станции. При работах по выделению и очистке НК (ДНК или РНК) из биологического материала на всех этапах необходимо использовать расходные материалы (пластиковые пробирки и наконечники) только с маркировкой DNase, RNase-free.

Для образцов мочи следует предварительно провести предобработку пробы: взболтать флакон с мочой. Перенести 1,0 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугировать 5 мин при 10 000 х

х 10 000 g. При наличии большого количества солей ресуспендировать только верхний слой осадка солей в объеме 1,0 мл и затем снова центрифугировать. Полностью удалить надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник. К осадку добавить транспортную среду до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки на вортексе. Затем полученный материал использовать для экстракции НК.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С или в течение года при температуре не выше минус 16 °С. Пробы РНК не рекомендуется хранить более 30 мин из-за крайней нестабильности молекул РНК.

Основные требования при проведении этапа выделения и очистки ДНК или РНК

На этапе выделения ДНК или РНК обязательно должен быть использован внутренний контрольный образец (ВКО), содержащий рекомбинантный препарат ДНК или РНК в зависимости от типа аналита и методики. ВКО с известной концентрацией добавляется в каждую пробу на этапе выделения НК и в результате проходит через все этапы анализа одновременно с изучаемым биологическим образцом. ВКО служит контролем эффективности выделения, амплификации и детекции.

При тестировании любого числа образцов биологического материала (даже единичного образца) необходимо параллельно тестировать отрицательный контрольный образец (ОКО) - образец заведомо не содержащий искомый возбудитель. Служит для контроля возможной контаминации во время экстракции НК и при приготовлении амплификационных смесей. При тестировании более 10 клинических образцов рекомендуется параллельно тестировать не меньше двух ОКО.

Принцип метода ПЦР

При проведении исследования с использованием метода ПЦР следующим этапом анализа является реакция амплификации ДНК с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров.

Для детекции продуктов амплификации с электрофоретической детекцией продукт амплификации извлекают из пробирок и вносят его в 1,8% агарозный гель, содержащий бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией и фотографированием геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме полос специфической ДНК и ДНК ВКО.

Для детекции продуктов амплификации с гибридизационно-флуорес- центной детекцией используют один или несколько дополнительных олигонуклеотидных зондов, комплементарных области, расположенной между праймерами. Данные зонды мечены специальными красителями и гасите
лями флуоресценции, которые при накоплении специфического продукта амплификации флуоресцируют при заданной длине волны. Для амплификации и детекции флуоресцентного сигнала используют специальные приборы, которые позволяют регистрировать флуоресцентный сигнал.

Результаты ПЦР-КТ интерпретируют на основании данных об уровне флуоресцентного сигнала относительно фона по соответствующим каналам для контрольных образцов и проб ДНК, полученных с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (согласно инструкции к используемому прибору). Интерпретация производится автоматически с помощью программного обеспечения используемого прибора и предварительно заданных в нем настроек теста, назначенного при проведении детекции согласно инструкции к набору реагентов.

Результаты ПЦР-РВ интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией положительного образца и величины «порогового цикла», Ct - цикла, на котором кривая флуоресценции пересекает линию порога.

Принцип метода на основе обратной транскрипции НАСБА (NASBA)

NASBA - изотермическая амплификация НК, которая основана на экспоненциальном накоплении одноцепочечных фрагментов РНК за счет конкурентного действии трех ферментов - AMV-RT (обратной транскриптазы вируса миобластомы птиц), РНКазы-Н и Т7-РНК полимеразы в комбинации со специфичными РНК-мишени олигонуклеотидными праймерами. Реакция амплификации протекает при 41 °C. Детекция продуктов амплификации НАСБА происходит в режиме реального времени с помощью флуоресцентно-меченых зондов - «молекулярных маячков» (molecular beacons), состоящих из последовательности зонда, которые взаимодействуют со специфическим продуктом реакции амплификации, с двумя короткими фланкирующими последовательностями, комплементарными друг другу (arm-последовательности). Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией положительного образца.

Основные требования при проведении ПЦР и НАСБА амплификации

На этапе выделения амплификации обязательно должны быть использованы:

  • отрицательный контроль амплификации (К-) - образец, заведомо не содержащий НК искомого возбудителя, который служит для контроля возможной контаминации реактивов или оборудования продуктами амплификации предыдущих исследований;
  • положительный контрольный образец (К+) - образец, содержащий фрагмент генома исследуемого возбудителя, который служит для контроля качества реактивов, работы прибора, условий амплификации.

Результаты исследования и их интерпретация

Прежде чем анализировать полученные результаты, необходимо оценить качество прохождения всего исследования. Должны быть соблюдены следующие требования:

  • результат тестирования образцов ОКО, K-, К+ и результат ВКО для анализируемых образцов соответствуют требованиям, указанным в инструкции к набору реагентов;
  • если для положительного контроля ПЦР (К+) значение отсутствует, необходимо повторить амплификацию для всех проб, для которых отсутствует значение положительного результата;
  • если для отрицательного контроля экстракции ДНК (ОКО) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) зафиксирован положительный результат при регистрации результатов амплификации ДНК или РНК микроорганизмов, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, для которых зафиксирован положительный результат, начиная с этапа экстракции ДНК или РНК.
  • Операционные характеристики

Основные характеристики тестов для выявления ДНК или РНК возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis) - аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, которые должны быть указаны в инструкциях к используемому набору реагентов.

Аналитическая чувствительность отражает минимальное количество аналита (ДНК или РНК) в 1,0 мл образца, которое может быть обнаружено тестом в 100% случаев. Аналитическая чувствительность тестов, предназначенных для выявления возбудителей ИППП как патогенных микроорганизмов должна обеспечивать их выявление при наличии в биологическом материале в концентрации 103 геномных эквивалентов в 1,0 мл и меньше.

Аналитическая специфичность - способность теста определять данный конкретный аналит (например, ДНК или РНК C.trachomatis) в окружении других аналогичных аналитов (например, ДНК или РНК других микроорганизмов, человека и др.).

4. Регистрация результатов анализа

Результаты анализа регистрируют в лаборатории в рабочем журнале и в унифицированной форме бланка. Бланк должен содержать название лаборатории и медицинской организации; информацию о пациенте, достаточную для его идентификации; название биологического материала и всех исследуемых показателей; дату получения пробы и, если это необходимо, время получения; результаты исследования; фамилию и подпись сотрудника, выполнившего исследование. Порядок выдачи результатов должен быть определен инструкцией, утвержденной руководителем медицинской организации.

При использовании качественных методов для выявления ДНК или РНК возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis) результат исследования представляется как: ДНК (или РНК) возбудителя «Обнаружена» или «Не обнаружена».

5. Обеспечение качества выполнения технологии

Программы обеспечения качества

Программы обеспечения качества включают последовательный мониторинг каждого аспекта процедуры для обеспечения гарантии достаточно высоких возможностей диагностики и наблюдения состояния пациента. Программы обеспечения качества должны включать все этапы работы и устанавливать связи между всеми составляющими процесса (пациент, лаборатория, врач-клиницист). Проведение контроля качества лабораторных исследований, заключающегося в тестировании контрольных материалов (внутрилабораторный контроль качества и участие в программе внешней оценки качества), является только одним из аспектов обеспечения качества. Контроль необходим и на этапах сбора образца, хранения, доставки, ручной обработки, ведения регистрации, выдачи документов. Нуждается в контроле также и техническая компетентность персонала, что предполагает непрерывное продолжение образования.

Для успешного осуществления всех контрольных мероприятий необходимо следовать правилам, изложенным в национальных стандартах ГОСТ Р 53133.3-2008 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований» и ГОСТ Р ИСО 15189-2009 «Лаборатории медицинские - частные требования к качеству и компетентности».

Ведение регистрации контрольных мероприятий

Регистрация проведения контроля должна осуществляться на всех

уровнях: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом, для каждого этапа должны быть разработаны и документированы правила проведения всех процедур.

Для врачей-клиницистов должна быть разработана форма направления на исследование, включающая дату назначения и взятия пробы, информацию для идентификации пациента, диагноз, сведения о приеме лекарственных средств.

Для персонала, осуществляющего взятие материала, должна быть разработана инструкция, содержащая условия подготовки пациента и описание процедуры взятия биоматериала. В инструкцию по доставке пробы должны быть включены условия и сроки хранения проб и правила безопасной транспортировки.

Для персонала лаборатории должны быть определены критерии приема и отказа в приеме проб, требования по регистрации пробы, обработке, маркировке и хранению пробы до анализа.

Аналитический этап проводится в соответствии с инструкциями к наборам реагентов.

На постаналитическом этапе необходимо разработать правила оценки приемлемости результатов анализа, которые должны включать аналитическую достоверность по данным внутрилабораторного контроля качества, проверку правильности регистрации. Форма выдачи результатов должна быть утверждена в учреждении и согласована с лечебными отделениями.

Регистрация должна также охватывать контрольные материалы и оценку приборов.

Контроль качества материалов и оборудования

Контроль за качеством материалов и оборудования включает:

  • тщательное соблюдение сроков годности реактивов и наборов реагентов, что предотвращает использование испорченных или просроченных реактивов и является важной составляющей обеспечения качества;
  • наличие на рабочем месте инструкции по эксплуатации каждого прибора;
  • наличие журналов регистрации сервисного обслуживания и ремонта .

Внутрилабораторный контроль качества исследований

Внутрилабораторный контроль качества представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых в лаборатории результатов. Для этого в каждой серии (постановке) тестируются контрольные образцы: ОКО, К+ и К-. Для внутрилабораторного контроля качества исследований рекомендуется использовать содержащие выявляемые организмы или их НК контрольные образцы, прошедшие государственную регистрацию в установленном порядке и разрешенные к применению на территории РФ (при их наличии).

Для контроля за контаминацией лаборатории продуктами амплификации необходимо проводить тестирование смывов не реже 1 раза в неделю (в соответствии с МУ 1.3.2569-09).

Внешняя оценка качества

Внешняя оценка качества необходима для подтверждения правильности результатов лабораторных исследований и сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях. Каждая лаборатория обязана участвовать в программах внешней оценки качества. Специальными организациями, имеющими лицензию на проведение межлабораторной оценки качества выполнения лабораторных исследований, в т. ч. молекулярно-биологических исследований, между лабораториями периодически (несколько раз в год) распределяются контрольные образцы с установленным содержанием НК возбудителей ИППП для контроля правильности проводимых исследований. Полученные лабораториями результаты регистрируются, и заключения рассылаются участвующим лабораториям для сравнительной оценки правильности выполнения исследования. В случае неудовлетворительной оценки результатов лаборатория должна принимать соответствующие меры для исправления своих ошибок.

Непрерывное образование специалистов

Для обеспечения качества анализа квалификация персонала должна соответствовать нормативным требованиям. Весь персонал лаборатории периодически (раз в пять лет) проходит обучение на циклах усовершенствования, которые проводятся медицинскими образовательными учреждениями, имеющими соответствующую лицензию. Каждый специалист обязан заниматься самообразованием. Лаборатория обеспечивается доступной для пользования современной литературой, включая периодические издания по лабораторной диагностике и атласы. Специалистам лаборатории необходимо участвовать в конференциях и семинарах.

Все этапы молекулярно-биологических исследований должен выполнять только специально обученный персонал.

Трудозатраты персонала лаборатории на выполнение технологии «Выявление ДНК и РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis)»

Таблица 2

Трудозатраты в минутах, мин*

Вид исследования

Специалист со средним образованием

Врач клинической лабораторной диагностики, биолог

Регистрация поступившего материала

5

Этапы молекулярно-биологического исследования

Выделение и очистка НК

20**-60

Проведение реакции амплификации

20

Регистрация, оценка, расчет, интерпретация результатов

10

* Реальный расход времени зависит от использования конкретной методики и требует подтверждения с помощью хронометража в каждом лечебном учреждении.

** При использовании экспресс-методов выделения.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка
      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...







      Наши продукты






















      © 2006–2018 ООО «МЦФЭР», медиагруппа «Актион-МЦФЭР»

      Журнал «Здравоохранение» –
      практический журнал для главного врача.

      Все права защищены. Полное или частичное копирование любых материалов сайта возможно только с письменного разрешения редакции журнала «Здравоохранение».
      Нарушение авторских прав влечет за собой ответственность в соответствии с законодательством РФ.

      Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
      Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать документ на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 12 000 статей
      — 8 000 ответов на вопросы
      — 200 видеосеминаров
      — готовые формы и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные сервисы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×