text

🎁 УЛЁТНЫЕ СКИДКИ 30%! Поймать »

Здравоохранение

Проект стандартизованной технологии «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови»

  • 15 августа 2013
  • 53

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

1. Цель исследования

Настоящая стандартизованная технология устанавливает единые требования к определению концентрации РНК ВИЧ в плазме крови в клинико-диагностических и микробиологических (бактериологических) лабораториях медицинских организаций.

Концентрация РНК ВИЧ (вирусная нагрузка) является важным лабораторным критерием для оценки тяжести течения заболевания, прогноза эффективности терапии, а также оценки эффективности терапии.

2. Требования к обеспечению выполнения технологии

2.1. Требования к специалистам и вспомогательному персоналу

Исследование «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови» имеют право проводить врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи, прошедшие первичную специализацию по клинической лабораторной диагностике и периодическое повышение квалификации в установленном порядке. Врачи и биологи должны иметь удостоверение о краткосрочном повышении квалификации «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» на лицензированных курсах.

Врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи осуществляют контроль всего технологического процесса и непосредственно выполняют этапы молекулярно-биологического исследования по определению концентрации РНК ВИЧ, требующие высокой квалификации и специальной подготовки, принимают

решение о необходимости дополнительных исследований (повторное проведение измерения, исследование с разведением исходного образца, исследование с предварительным ультрацентрифугированием образца и т. п.). Врачи клинической лабораторной диагностики консультируют врачей-ин- фекционистов и помогают в интерпретации результатов исследований.

Подготовительную работу (прием поступающих в лабораторию образцов и сопроводительных документов; регистрацию полученного биологического материала; проведение технических манипуляций, не требующих высокой квалификации, - подготовка помещений, ламинарных боксов, расходных материалов, утилизацию использованных расходных материалов и остатков использованных биологических образцов) выполняет специалист со средним медицинским образованием и соответствующей квалификацией (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант), имеющий сертификат специалиста и прошедший периодическое повышение квалификации в установленном порядке.

Врач клинической лабораторной диагностики (врач-бактериолог, врач-вирусолог, биолог) должен знать:

  • показания к назначению исследования, критерии оценки результатов исследования;
  • все этапы подготовительной работы и проведения исследования: правила взятия крови, правила техники безопасности при работе с потенциально инфицированным биологическим материалом, требования к доставке и хранению материала, правила центрифугирования цельной крови для получения плазмы крови, методики проведения исследования.

Должен уметь:

  • провести исследование «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови», обработать результаты.

2.2. Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала

Исследования «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови» выполняются в организациях, имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ.

Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы, методами амплификации нуклеиновых кислот связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и/или ампликонами исследуемых проб, помещений, оборудования. Лица, отвечающие за сбор, доставку и анализ образцов крови, должны руководствоваться правилами и техникой безопасности при работе с биологическими материалами. Все образцы биологического материала, поступающего на исследование, необходимо считать потенциально опасными, т. к. они могут содержать патогенные микроорганизмы.

Противоэпидемический режим работы лаборатории, выполняющей исследования «Определение концентрации РНК ВИЧ», должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08, регламентирующими работу с микроорганизмами I—II и III—IV групп патогенности соответственно. Допускается проведение данных исследований в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III-IV групп патогенности, только в тех случаях, для которых разработаны и утверждены нормативные документы, регламентирующие порядок проведения таких исследований в условиях данной лаборатории (МУ 1.3.2569-09).

Персонал, непосредственно участвующий в проведении анализа «Определение концентрации РНК ВИЧ», обязан соблюдать общие правила работы в молекулярно-биологических лабораториях (МУ 1.3.2569-09), строго придерживаться общих стандартов по формированию и поддержанию безопасности рабочей среды в медицинских лабораториях при манипуляциях с пробами пациентов, химическими реактивами и другими объектами потенциальной опасности для здоровья людей (ГОСТ Р 52905-2007).

Организация помещений, требования к оборудованию и правила работы в лаборатории, выполняющей исследования по определению концентрации РНК ВИЧ, должны соответствовать требованиям, изложенным в МУ 1.3.2569-09.

Все сотрудники обязаны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам, используемым в технологии (амплификаторы, центрифуги, термостаты и др.); персонал, работающий с реактивами, должен быть обучен обращению с ними, использовать средства персональной защиты, соблюдать правила личной гигиены.

Для предупреждения пожара необходимо соблюдать правила пожарной безопасности в соответствии с действующими нормативными документами.

Сбор, временное хранение, обеззараживание и транспортировка потенциально опасных отходов, загрязненных остатками биологического материала, образующихся в процессе выполнения технологии, должны проводиться в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами (СанПиН 2.1.7.2790-10).

Инфицированные и потенциально инфицированные отходы (материалы и инструменты; предметы, загрязненные кровью и/или другими биологическими жидкостями) - отходы класса Б - подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции) / обезвреживанию. Выбор метода обеззараживания/обезвреживания определяется возможностями организации, осуществляющей медицинскую деятельность. Отходы класса Б собираются в одноразовую мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) желтого цвета или имеющую желтую маркировку. Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов.

2.3. Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии

2.3.1. Лабораторное оборудование

Все электрические устройства и приборы должны быть зарегистрированы на территории РФ, иметь сертификат соответствия ГОСТ Р Госстандарта России и отвечать требованиям соответствующих нормативных документов, что позволяет предотвратить их взрыво- и пожароопасность.

Оснащение отдельных рабочих зон производится в соответствии с нижеприведенными перечнями.

Зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала.

  • бокс биологической безопасности II или III класса биологической защиты;
  • центрифуга лабораторная, обеспечивающая не менее 800 g, для пробирок объемом 5,0-10,0 мл;
  • набор автоматических пипеток переменного объема;
  • одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 или 2,0 мл;
  • одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл;
  • штативы для наконечников и микропробирок объемом 1,5-2,0 мл;
  • холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 16 °С;
  • морозильная камера, поддерживающая температуру не выше минус 68 °С (при необходимости, в случае длительного хранения биологического материала);
  • емкость с регламентируемым дезинфицирующим раствором;
  • емкость с 70%-м этиловым спиртом.
  • Зона выделения РНК из образцов биологического материала:
  • бокс биологической безопасности II или III класса биологической защиты;
  • твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5-2,0 мл или 5,0 мл с диапазоном рабочих температур 25-100 °С;
  • настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5-2,0 мл, до 10 000 g;
  • настольная центрифуга с охлаждением для микропробирок типа «Эп- пендорф» объемом 1,5—2,0 мл (не менее 24 000 g);
  • микроцентрифуга/вортекс;
  • вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
  • набор автоматических пипеток переменного объема;
  • одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5—2,0 мл;
  • штативы для микропробирок на 1,5-2,0 мл и наконечников;
  • магнитные штативы для микропробирок на 1,5—2,0 и 5,0 мл;
  • одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 и 1000 мкл с фильтром;
  • одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл;
  • холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 16 °С (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот);
  • морозильная камера, поддерживающая температуру ниже минус 68 °С (для хранения препаратов нуклеиновых кислот). Не допускается хранение препаратов нуклеиновых кисдот в одном холодильнике с компонентами набора ддя выделения нуклеиновых кисдот! емкость с дезинфицирующим раствором.

С целью автоматизации процедуры выделения нуклеиновых кислот допускается использование автоматизированного оборудования.

Зона проведения реакции обратной транскрипции и амплификации:

  • программируемые термоциклеры (персональные, многомодульные, с функцией амплификации в режиме «реального времени») и автоматизированные станции;
  • бокс биологической безопасности II и III класса или настольный бокс с бактерицидной лампой (ПЦР-бокс; УФ-бокс);
  • микроцентрифуга/вортекс;
  • набор автоматических пипеток переменного объема;
  • штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников;
  • одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 (0,2) мл;
  • одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10, 100 и 200 мкл, свободные от РНКаз;
  • холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 °С и не выше минус 18 °С (для хранения наборов, предназначенных для проведения реакций обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот);
  • емкость для сброса отработанных расходных материалов.

С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования.

2.3.2. Реактивы

Для проведения исследования «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови» могут быть использованы только наборы реагентов, зарегистрированные на территории РФ в установленном порядке. Наборы реагентов должны содержать инструкцию на русском языке, описывающую все этапы исследования, с информацией о линейном диапазоне теста.

Набор реагентов или комплект наборов реагентов должен содержать все реагенты, необходимые для проведения всех этапов исследования (за исключением реагентов, указанных в инструкции как необходимые, но не входящие в комплектацию, например этанола).

2.3.3. Прочий расходуемый материал

Перчатки для работы, дезинфицирующие средства.

3. Характеристика методик выполнения технологии

3.1. Взятие образцов крови

Взятие крови производят натощак или через 3 ч после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в специальную вакуумную систему типа Vacuett (сиреневые крышки - 6,0% ЭДТА). Пробирку аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом. Взятие материала следует проводить в резиновых перчатках, соблюдая правила асептики.

Кровь должна поступать свободным током непосредственно в пробирку, содержащую антикоагулянт К2ЭДТА. Взятие крови шприцем без антикоагулянта с последующим переливанием в пробирку запрещено из- за формирования микросгустков и гемолиза.

В качестве антикоагулянта возможно использовать цитрат натрия. В этом случае венозная кровь набирается в пробирки, содержащие 3,8%-й раствор цитрата натрия, в соотношении 1 : 9. Однако при этом происходит значительное разведение крови, что влияет на конечный результат.

Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!

Необходимо строго соблюдать объем взятой крови, который должен соответствовать указанной отметке на пробирке. Несоблюдение этого условия, а также недостаточно тщательное перемешивание крови приведет к изменению конечной концентрации антикоагулянта во взятой крови, что может повлечь за собой появление микросгустков и, как следствие, неправильное определение концентрации РНК вируса.

Не следует использовать пробирки с выпаренным раствором К2ЭДТА, приготовленные в условиях лаборатории. При испарении на дне пробирки образуются крупные кристаллы К2ЭДТА, которые очень медленно растворяются в крови. Это может приводить к образованию фибриновых нитей в верхней части пробы крови.

3.2. Идентификация образца

В направление на исследование должна быть включена следующая информация: фамилия, имя и отчество (инициалы) пациента, возраст или дата рождения, пол, отделение медицинского учреждения и палата (в стационаре), номер медицинской карты (идентификационный номер), диагноз с указанием стадии заболевания, дата и время взятия образца крови, время доставки образца в лабораторию, фамилия и инициалы врача, назначившего исследование. Должны быть перечислены все показатели, которые требуется исследовать. Если пациент получает антиретровирусную терапию, необходимо указать принимаемые пациентом противовирусные препараты и дату начала терапии.

Немаркированные или неправильно маркированные образцы не пригодны для исследования, о чем следует уведомить врача-инфекциониста, назначившего анализ.

3.3. Приемлемость образца для исследования

После доставки образца крови или плазмы крови в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на анализ, маркировку пробирки (код или фамилия больного и другие данные должны быть идентичны данным, указанным в бланке-направлении) и зарегистрировать поступивший материал в рабочем журнале в бумажной или электронной форме.

Так как точность результатов исследования во многом зависит от качества доставленного образца, необходимо неукоснительно следовать правилам сбора и транспортировки крови, четко контролировать время и условия хранения проб до выполнения анализа.

3.3.1. Требования к обработке и хранению образцов крови для определения концентрации РНК ВИЧ

Кровь, собранная для определения концентрации РНК ВИЧ, может храниться при температуре 2-8 °С не более 6 ч. Цельную кровь нельзя замораживать!

Рекомендуется сразу после взятия доставлять образцы крови в лабораторию. Если такой возможности нет, образец крови должен быть центрифугирован не позднее 6 ч после взятия крови для получения плазмы крови.

Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800-1600 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем отбирают плазму отдельными наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл (объем образца зависит от используемой методики).

Допускается не бодее чем трехкратное замораживание-оттаивание образца пдазмы крови, поэтому образцы плазмы для длительного хранения желательно разлить небольшими порциями (объем зависит от используемой методики) в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл.

Образцы плазмы крови можно хранить:

  • при температуре от 2 до 8 °С - не более 3 суток;
  • при температуре не выше минус 68 °С - длительно (не менее 1 года).
  • Не рекомендуется хранить образцы плазмы крови при температуре минус 16-25 °С.

Для определения концентрации РНК ВИЧ нельзя использовать кровь / плазму крови, если:

  • наблюдаются признаки свертывания крови (присутствие микросгустков);
  • наблюдаются признаки гемолиза;
  • между временем взятия крови и получением плазмы крови прошло
  • более 6 ч;
  • кровь была заморожена.

Не следует использовать для анализа сыворотку крови ввиду значительного занижения количественных результатов.

3.4. Описание хода выполнения данной стандартизованной технологии

Определение концентрации РНК ВИЧ проводится с использованием наборов реагентов, зарегистрированных на территории РФ в установленном порядке. Набор реагентов или комплект наборов реагентов должен содержать все реагенты, необходимые для проведения всех этапов исследования (за исключением реагентов, указанных в инструкции как необходимые, но не входящие в комплектацию, например, этанола).

При проведении исследования нельзя использовать реагенты из наборов реагентов разных производителей, если это не предусмотрено инструкцией!

Не рекомендуется использовать реагенты из разных лотов и разных комплектов одного производителя. В противном случае необходима самостоятельная валидация теста с использованием контрольных материалов (если это предусмотрено и детально описано в инструкции к набору реагентов).

При проведении мониторинга вирусной нагрузки у одного пациента рекомендуется пользоваться наборами реагентов одного формата и одного производителя.

Стандартизованная технология включает четыре основных этапа:

  • первичная обработка биологического материала;
  • выделение и очистка РНК;
  • реакция амплификации (либо реакция разветвленной ДНК) с детекцией продуктов;
  • анализ и обработка результатов с помощью специализированных компьютерных программ.

Все этапы технологии должны выполняться в строгом соответствии с инструкцией к набору реагентов.

3.5. Описание стандартных операционных процедур

Для определения концентрации РНК ВИЧ используются молекулярно-биологические методы, основанные на двух принципах:

  • ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (real-time ПЦР);
  • метод разветвленной ДНК (branched DNA).

3.5.1. Выделение и очистка РНК

Первым этапом молекулярно-биологического анализа, выполняемого любым из названных методов, является выделение РНК из образца плазмы крови и очистка РНК. Для этого используют реагенты, входящие в состав набора. Стандартные этапы выделения и очистки РНК состоят из лизиса с использованием хаотропных солей (например, гуанидинтиоцио- ната), очистки РНК от белков и полисахаридов, сорбции РНК на частицах или преципитации на дно пробирки, элюции РНК в буфере. Для этапа выделения и очистки РНК могут быть использованы автоматизированные станции.

Выделенную из плазмы РНК рекомендуется хранить не более 30 мин при температуре 2-8 °С из-за крайней нестабильности молекул РНК. При необходимости образец РНК может быть заморожен при температуре не выше минус 68 °С на срок до 1 года.

Для повышения чувствительности исследования «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови» рекомендуется использовать методику предварительного ультрацентрифугирования плазмы крови. Для этого 0,5-1,0 мл плазмы крови центрифугируют в течение 1 ч при температуре 2-8 °С при 24 000 g или более, супернатант удаляют, а полученный осадок вирусных частиц выделяют по описанной в инструкции к набору реагентов методике. Показано, что при таких условиях практически все вирусные частицы, содержащиеся в образце, осаждаются на дно пробирки.

Основные требования при проведении этапа выделения и очистки РНК

На этапе выделения РНК обязательно должен быть использован внутренний контрольный образец (ВКО), содержащий искусственно созданную молекулу РНК. ВКО с известной концентрацией РНК добавляется в каждую пробу на этапе выделения РНК и в результате проходит через все этапы анализа одновременно с изучаемым образцом крови. ВКО служит контролем эффективности выделения, амплификации (гибридизации) и детекции. В некоторых наборах реагентов ВКО дополнительно может служить количественным стандартом, относительно которого проводится расчет концентрации РНК вируса в образце.

При тестировании любого числа образцов крови (даже единичного образца) необходимо параллельно тестировать как минимум два положительных контрольных образца (ПКО) с высокой и низкой концентрацией РНК и один отрицательный контрольный образец (ОКО). При тестировании более 10 клинических образцов рекомендуется параллельно тестировать не меньше двух ОКО.

3.5.2. Принцип метода real-time ПЦР

При проведении исследования с использованием метода ПЦР следующим этапом анализа является реакция обратной транскрипции с последующей амплификацией кДНК с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров.

Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени (real-time ПЦР) используют один или несколько дополнительных олигонуклеотидных зондов, комплементарных области, расположенной между праймерами. Данные зонды мечены специальными красителями и тушителями флуоресценции, которые при накоплении специфического продукта амплификации флуоресцируют при заданной длине волны. Для амплификации и детекции флуоресцентного сигнала используют специальные приборы, которые позволяют регистрировать флуоресцентный сигнал на каждом цикле ПЦР-амплификации. С накоплением специфического продукта амплификации уровень сигнала пропорционально растет.

Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией положительного образца и величины порогового цикла, Cf-цикла, на котором график флуоресценции пересек линию порога. Для калибровки реакции и проведения количественных расчетов с помощью специализированного программного обеспечения строят график зависимости величины порогового цикла от логарифма исходной концентрации стандартов, который имеет линейный характер. Далее, исходя из полученных значений пороговых циклов для исследуемых образцов, рассчитывают их концентрации по полученному калибровочному графику. Все описанные расчеты проводятся автоматически с помощью специализированного программного обеспечения.

3.5.3. Принцип метода разветвленной ДНК (branched DNA)

При определении концентрации РНК методом разветвленной ДНК к исследуемой РНК добавляется улавливающий зонд, один конец которого комплементарен мишени, а другой - определенному концу усиливающего зонда, который называют разветвленной ДНК. Эта молекула напоминает расческу, у которой все зубья представлены идентичными последовательностями нуклеотидов, а ручка комплементарна первому олигонуклеотидному зонду. В системе также существует второй зонд, комплементарный зубьям усиливающего зонда и меченный флуорофором. Таким образом многократно усиливается сигнал флуоресценции (амплификация сигнала), который обнаруживают в случае наличия РНК ВИЧ.

3.5.4. Результаты исследования и их интерпретация Количественное измерение РНК, независимо от используемого метода, возможно благодаря использованию в анализе калибровочных образцов (стандартов) с известной концентрацией нуклеиновых кислот.

В различных наборах реагентов реализованы различные способы построения калибровочных кривых:

  • внешние калибровочные стандарты, содержащие РНК, используют для однократной калибровки каждого лота набора реагентов или каждой серии (постановки);
  • ДНК-калибраторы используются для расчета концентрации кДНК мишени; для расчета концентрации РНК вируса необходимо использовать концентрацию РНК ВКО, добавляемую в образец, и специальную формулу расчета.

Построение калибровочных кривых и последующий расчет концентрации вирусных частиц в исследуемом образце проводятся с помощью специализированных компьютерных программ, которые должны поставляться вместе с набором реагентов или инсталлироваться одновременно с термоциклером и другим оборудованием, предназначенным для определения концентрации РНК ВИЧ.

Прежде чем анализировать результаты, полученные для образцов крови, необходимо оценить качество прохождения всего исследования. Переходить к анализу результатов для биологических образцов можно только при соблюдении следующих требований:

  • ОКО дает валидный отрицательный результат;
  • значения ПКО укладываются в заданный диапазон концентраций (для каждого лота данный диапазон может отличаться);
  • ВКО для анализируемых образцов соответствует требованиям, указанным в инструкции к набору реагентов.

Для каждого набора реагентов важно знать линейный диапазон теста, который должен быть указан в инструкции к набору. Важно помнить, что при использовании предварительного ультрацентрифугирования образца плазмы крови линейный диапазон исследования меняется. Условия ультрацентрифугирования и соответствующий линейный диапазон также должны быть указаны в инструкции.

В тех случаях, когда концентрация РНК, определенная в процессе исследования, находится в пределах линейного диапазона используемого набора реагентов, исследование может считаться выполненным и результат может быть выдан по установленной форме.

В тех случаях, когда концентрация РНК оказалась меньше нижнего порога линейного диапазона, существует два варианта решения:

  • результат может быть выдан в виде значения меньше нижнего порога (например, менее 50 копий/мл);
  • если первое исследование было проведено без предварительного ультрацентрифугирования, то можно провести повторное исследование образца с предварительным ультрацентрифугированием (в соответствии с инструкцией).

В тех случаях, когда концентрация РНК оказалась выше верхнего порога линейного диапазона, исследование необходимо повторить, предварительно подвергнув образец плазмы крови разведению с помощью негативной плазмы крови (не содержащей РНК и антигенов ВИЧ и антител к нему). Если результат такого определения концентрации РНК находится в пределах линейного диапазона, его значение следует умножить на коэффициент разведения. Рекомендуется проводить разведение в 10 раз.

3.5.5. Операционные характеристики

Основные характеристики тестов для определения вирусной нагрузки - аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, линейный диапазон, воспроизводимость измерений. Поскольку РНК ВИЧ не входят в число аналитов, определяющих состав крови и мочи, изменения которых проявляются при разных формах патологии и определяются в диагностических целях, ряд требований ГОСТа к качеству таких методик в данном случае применен быть не может.

Аналитическая чувствительность отражает минимальное количество аналита (РНК) в 1 мл образца, которое может быть обнаружено тестом в 100% случаев. Аналитическая чувствительность тестов, предназначенных для определения концентрации РНК ВИЧ, должна составлять 50 копий/мл и менее (такая чувствительность может быть достигнута при использовании ультрацентрифугирования большого объема образца). Требования к такой чувствительности основываются на клинических рекомендациях, согласно которым антиретровирусная терапия может считаться эффективной только в том случае, если вирусная нагрузка составляет менее 50 копий/мл.

Аналитическая специфичность - способность теста определять данный конкретный аналит (РНК ВИЧ) в образцах, содержащих другие похожие аналиты (например, РНК других вирусов, человека и др.). Учитывая значимость ложноположительных результатов, аналитическая специфичность тестов, предназначенных для определения концентрации РНК ВИЧ, должна приближаться к 100% (не менее 99,0%).

Линейный диапазон измерений - интервал, в пределах которого тест точно измеряет концентрацию РНК. Более важной в оценке тестов для определения вирусной нагрузки признана нижняя граница (порог) линейного диапазона (линейности), поскольку эта величина имеет большое значение для эффективного мониторинга терапии и должна быть <50 копий/мл или <50 МЕ/мл (порог эффективной супрессии вируса).

Воспроизводимость тестов, предназначенных для определения концентрации РНК ВИЧ, оценивают по значению коэффициента вариации. Для молекулярно-биологических тестов, основанных на методах амплификации мишени (сигнала), коэффициент вариации в среднем колеблется в пределах 30,0-35,0% (для значений концентрации РНК, представленных в абсолютных величинах, в копиях/мл или МЕ/мл).

4. Регистрация результатов анализа

Результаты анализа регистрируют в лаборатории в рабочем журнале (в бумажной или электронной форме) и в унифицированной форме бланка выдачи результатов. Бланк должен содержать название лаборатории и медицинской организации; информацию о пациенте, достаточную для его идентификации; название биологического материала и всех исследуемых показателей; дату получения пробы и, если это необходимо, время получения; результаты исследования; название использованного набора реагентов; линейный диапазон измерения; фамилию и подпись сотрудника, выполнившего исследование. Учитывая значимость исследования, с целью обеспечения дополнительного контроля содержимое бланка должно быть заверено подписью заведующего лабораторией или другого уполномоченного сотрудника. Порядок выдачи результатов должен быть определен инструкцией, утвержденной руководителем медицинской организации. Все отказы от выполнения исследования крови необходимо регистрировать в рабочем журнале (в бумажной или электронной форме) с указанием их причин.

Концентрация РНК ВИЧ в плазме крови может быть представлена в копиях/мл и/или в МЕ/мл. Однако в большинстве российских и зарубежных рекомендаций по клинической интерпретации результатов вирусной нагрузки ВИЧ данный показатель представлен в копиях/мл. Поэтому целесообразнее представлять результаты в копиях/мл.

Следует учитывать, что, если в ходе измерения величина вирусной нагрузки оказывается ниже границ линейного диапазона, результат должен быть выдан как «менее чем нижний порог линейного диапазона». Если величина вирусной нагрузки выше границ диапазона, рекомендуют разведение образца на один порядок и повторное тестирование с последующим увеличением полученного результата в 10 раз.

5. Обеспечение качества выполнения технологии

5.1. Программы обеспечения качества

Программы обеспечения качества включают последовательный мониторинг каждого аспекта процедуры для обеспечения гарантии достаточно высоких возможностей диагностики и наблюдения состояния пациента.

Программы обеспечения качества должны включать все этапы работы и устанавливать связи между всеми составляющими процесса (пациент, лаборатория, врач-инфекционист). Проведение контроля качества лабораторных исследований, заключающегося в тестировании контрольных материалов (внутрилабораторный контроль качества и участие во внешней оценке качества), является только одним из аспектов обеспечения качества. Контроль необходим и на этапах сбора образца, хранения, доставки, ручной обработки, ведения регистрации, выдачи документов. Нуждается в контроле также и техническая компетентность персонала, ее повышение требует, в свою очередь, непрерывного продолжения образования медицинских работников.

Для успешного осуществления всех контрольных мероприятий необходимо следовать правилам, изложенным в национальных стандартах ГОСТ Р 53133.3-2008 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований» и ГОСТ Р ИСО 15189-2009 «Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности».

5.2. Ведение регистрации контрольных мероприятий

Регистрация проведения контроля качества должна осуществляться на всех уровнях: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом; для каждого этапа разрабатываются и документируются правила выполнения всех процедур.

Для врачей-инфекционистов должна быть разработана форма направления на исследование, включающая дату назначения исследования и взятия пробы, информацию для идентификации пациента, диагноз, сведения о приеме лекарственных средств.

Для персонала, осуществляющего взятие материала, должна быть разработана инструкция, регламентирующая условия подготовки пациента и процедуру взятия биоматериала. В инструкцию по доставке пробы должны быть включены условия и сроки хранения проб и правила безопасной транспортировки.

Для персонала лаборатории должны быть определены критерии приема и отказа в приеме проб, требования по регистрации пробы в рабочем журнале с использованием непрерывной нумерации (например, в течение года), обработке, маркировке и хранению пробы до анализа.

Аналитический этап проводится в соответствии с инструкциями к наборам реагентов.

Для постаналитического этапа необходимо разработать правила оценки приемлемости результатов анализа, которые должны включать аналитическую достоверность по данным внутрилабораторного контроля качества, проверку правильности регистрации. Форма выдачи результатов должна быть утверждена в учреждении и согласована с лечебными отделениями.

Регистрация должна также охватывать контрольные материалы и оценку приборов.

В каждой лаборатории необходимо разработать алгоритм обнаружения и коррекции ошибок, результатов, выходящих за контрольные пределы. Соответствующий документ необходимо довести до сведения сотрудников, выполняющих исследования по определению вирусной нагрузки.

Используемые наборы реагентов также должны регистрироваться в рабочем журнале, информация должна включать:

  • номер лота и срок годности;
  • дату использования;
  • все результаты пациентов и контроля качества с использованием конкретного лота;
  • идентификационные данные сотрудника, который выполняет исследование.

5.3. Внутрилабораторный контроль качества исследований

Внутрилабораторный контроль представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых в лаборатории результатов. Для этого в каждой серии (постановке) должны тестироваться два ПКО с низкой и высокой концентрацией РНК. Результаты измерения ПКО должны укладываться в указанный производителем диапазон.

Также согласно приказу Минздрава России от 07.02.2000 № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» и приказу Минздрава России от 26.05.2003 № 220 «Об утверждении отраслевого стандарта “Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов”» для проведения внутрилабораторного контроля качества исследований должны тестироваться аттестованные образцы, зарегистрированные и разрешенные к использованию в установленном порядке на территории РФ. Оценку погрешности количественных измерений, а также порядок проведения внутрилабораторного контроля следует выполнять в соответствии с названными приказами и ГОСТ 53133.2-2008 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов».

Для контроля за контаминацией лаборатории продуктами амплификации необходимо проводить тестирование смывов не реже 1 раза в неделю (в соответствии с МУ 1.3.2569-09).

5.4. Внешняя оценка качества

Внешняя оценка качества необходима для подтверждения правильности результатов лабораторных исследований и сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях. Каждая лаборатория обязана участвовать в программах внешней оценки качества. Специальными организациями, имеющими лицензию на проведение межлабораторной оценки качества выполнения лабораторных исследований, в т. ч. молекулярно-биологических исследований, между лабораториями периодически (несколько раз в год) распределяются контрольные образцы с установленным содержанием РНК вирусов для контроля правильности проводимых исследований. Полученные лабораториями результаты регистрируются, и заключения рассылаются участвующим лабораториям для сравнительной оценки правильности выполнения исследования. В случае неудов - летворительной оценки результатов лаборатория должна принимать соответствующие меры для исправления ошибок.

5.5. Непрерывное образование специалистов

Для обеспечения качества анализа квалификация персонала должна соответствовать сложности выполняемого исследования. Весь персонал лаборатории периодически (раз в пять лет) проходит обучение на циклах усовершенствования, которые проводятся медицинскими образовательными учреждениями, имеющими соответствующую лицензию. Каждый специалист обязан заниматься самообразованием. Лаборатория обеспечивается доступной для пользования современной литературой, включая периодические издания по лабораторной диагностике. Специалистам лаборатории необходимо участвовать в конференциях и семинарах.

Все этапы молекулярно-биологических исследований должен выполнять только специально обученный персонал.

6. Примерные трудозатраты персонала лаборатории на выполнение технологии «Определение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови»

Трудозатраты, мин*

Вид исследования

специалист со средним образованием

врач клинической лабораторной диагностики, биолог

1

2

3

Регистрация поступившего материала

5

Получение плазмы крови, подготовка образца к исследованию

10

 

Этапы молекулярно-биологического

исследования

Выделение и очистка нуклеиновых кислот

40**-60

Проведение реакций обратной транскрипции и амплификации

30

Регистрация, оценка, расчет, интерпретация результатов

20

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Зарегистрироваться
×
Журнал
Гость, Ваш бесплатный доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ» сгорает через

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.