Методы диагностики нарушений микрофлоры кишечника

88

Многочисленные исследования последних лет позволили изменить парадигму научных представлений о функционировании кишечной микрофлоры. Оказалось, что симбионтная микрофлора человека характеризуется сложной видовой структурой и большим индивидуальным разнообразием. Поэтому в настоящее время отсутствует единое мнение о том, что с точки зрения качественно-количественного состава представляет собой «здоровая» микрофлора. Выявлено, что «детская» микрофлора отличается от «взрослой» не только численностью представителей тех или иных родов синантропных бактерий, но, главное, - их популяционным соотношением и возрастными особенностями метаболизма. Видовой состав анаэробных бактерий (как у детей, так и у взрослых) более широк, чем представлялось ранее, причем именно строго анаэробные виды, функционирующие пристеночно, составляют количественную основу нормофлоры и играют важнейшую физиологическую роль, что не позволяет относиться к ним как к «остаточным» микроорганизмам.

Выяснилось, что существенное неблагоприятное значение имеет не присутствие конкретных видов бактерий в том или ином количестве, а изменение пропорций, соотношения и пространственного распределения бактериальных популяций в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), причем нарушения в большей степени касаются мукозо-ассоциирован- ных видов. Тем самым изменилось представление о том, что в качественно-количественном выражении представляет собой дисбиоз кишечника. Современный термин «структурный дисбиоз» (compositional dysbiosis) лучше отражает новое понимание аспектов функционирования нормофлоры.

Вместе с тем предложенная в нашей стране еще в 1991 г. классификация дисбиотических нарушений, основанная на качественно-количественном бактериологическом исследовании фекалий и используемая до сих пор, не дает возможности оценить роль строгих анаэробов, баланс популяций кишечных бактерий и поэтому нуждается в пересмотре.

Клиническую значимость дисбиотические нарушения имеют в том случае, если инициирующий их причинный фактор воздействует либо непрерывно в течение достаточно длительного времени (например, у пациентов с дисфункцией или хронической патологией ЖКТ), либо периодично с короткими «светлыми» промежутками, в течение которых микрофлора не способна самостоятельно восстановиться (например, при частых повторных острых респираторных заболеваниях). Именно формирование замкнутого круга патофизиологических процессов с весомой патогенетической ролью последствий стойкого и глубокого дисбиоза как такового требует проведения диагностических процедур для выбора терапевтической коррекции.

Методы диагностики микробиологических нарушений делятся на культуральные и некультуральные и решают различные задачи.

Культуральные методы диагностики не утратили своей актуальности, позволяют выделить конкретные микроорганизмы и определить их количество или патогенные свойства. Основаны на идентификации метаболических особенностей микробов методом, предложенным уже достаточно давно. Развитие современных технологий позволяет не только повысить эффективность идентификации определенных бактерий, но и значительно ускорить получение результатов исследования. Это достигается использованием: сред промышленного производства, позволяющих одномоментно с выращиванием определять антибиотикочувствительность и биохимические свойства микроорганизмов; дополнительных методик с применением стрипов или плат, с визуальным учетом результатов и определением вида микроорганизмов по кодовым справочникам и компьютерным программам; а также автоматических или полуавтоматических анализаторов. Культуральный метод имеет бол ьшую клиническую значимость при обследовании детей, особенно первого года жизни, т. к. позволяет оценить выявление примерно 40-60% групп бактерий, доминирующих в кишечном тракте. У взрослых его значение ниже, поскольку удельный вес популяций, которые могут быть выделены при его использовании, составляет не более 5-10% от общего числа кишечных бактерий.

Вместе с тем, учитывая видовое разнообразие возбудителей кишечных инфекций, идентификация микроорганизмов становится трудно достижимой. Для ответа на вопрос о патогенности требуется проведение большого набора микробиологических исследований. Особенно это касается определения патогенных серотипов эшерихий, наиболее генетически пластичного вида из семейства Enterobacteriacea, или условно патогенных микроорганизмов. Выделение анаэробных бактерий затруднено, т. к. требует специфических условий культивирования, поэтому широко не используется. Приходится совершенствовать диагностику дисбиоза кишечника на основании разработки пошаговых алгоритмов с определением факторов патогенности выделенных бактерий, чувствительности к специфическим бактериофагам или антибиотикам, что удлиняет и усложняет процедуру, но все же имеет косвенную клиническую значимость.

Изучение микробного сообщества в целом является особенно трудным, потому что большинство кишечных бактерий - строгие анаэробы и считается, что 50-80% представителей микрофлоры кишечника не может культивироваться в стандартных лабораторных условиях. Кроме того, бактериологический анализ фекальной микрофлоры обладает низкой воспроизводимостью и диагностической значимостью, поскольку зависит от ряда субъективных факторов, в т. ч. качества питательных сред, оснащенности лабораторий и отсутствия достаточной стандартизации микробиологических исследований. Поэтому результаты отдельных лабораторий могут отличаться.

Молекулярные методы исследования микрофлоры наиболее широко применяются в последние годы. Эти методы используют ген бактериальной 16S рибосомной РНК (рРНК) в качестве маркера генетического разнообразия и представлены в различных модификациях и комбинациях. В основном используются следующие методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР), микрочипы, секвенирование и филогенетические исследования, синтез рекомбинантных антигенов, обратная генетика. Исследования предназначены для определения кишечного микробиома (генома совокупности симбионтных бактерий в целом), сравнительного анализа генетических отличий между образцами в соответствии с поставленными задачами, выявления отдельных представителей патогенных или синантропных бактерий, вирусов и других микроорганизмов, определения факторов вирулентности бактерий, различных структурных и функциональных белков микроорганизмов. Без сомнения, эти методы диагностики перспективны и будут последовательно внедряться в научную и далее в практическую работу клиницистов. В настоящее время ПЦР-диагностика расценивается как информативный метод для выявления вирусов, возбудителей кишечных инфекций. По мнению некоторых авторов, для обнаружения патогенных бактерий, и особенно условно патогенных микроорганизмов или строгих анаэробов, этот метод не является достаточно надежным, т. к. возможны ложноотрицательные или ложноположительные реакции, а также недоступна адекватная количественная оценка.

Еще одна группа некультуральных методов изучения микрофлоры - хроматографические. В настоящее время используются: газожидкостная хроматография для определения основных метаболитов микрофлоры - короткоцепочечных (летучих) жирных кислот (КЖК) в различных модификациях (для достижения более точных результатов); газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией мономерных химических компонентов микробной клетки и метаболитов; ионная хроматография для выявления биогенных аминов, желчных и карбоновых кислот, ароматических соединений. Для быстрой идентификации анаэробов применяют также определение спектра КЖК методом капиллярного электрофореза и непрямой ультрафиолетовой детекции. Определение КЖК привлекает все большее внимание исследователей, т. к. позволяет оценить интегральную метаболическую активность микрофлоры, присутствующей в кишечнике. Недостатком метода является сложность интерпретации результатов в связи с индивидуальной вариабельностью и большим набором показателей, необходимостью учета скорости кишечного транзита и абсорбции КЖК, невозможностью обозначить этиологическую значимость конкретных микроорганизмов. Вместе с тем метод доступен, неинвазивен, позволяет оценить структуру микробиоты, учитывая вклад строгих анаэробов. По мнению исследователей, определение фекальных КЖК имеет значение для обнаружения изменений микрофлоры, которые недоступны бактериологическим методам, может отражать характерные типы микробиоты с различными метаболическими возможностями при патологических состояниях, является неотъемлемой частью диагностики бактериального роста. Профили КЖК при различных заболеваниях характеризуют тяжесть воспалительного процесса в кишечнике, его локализацию, отражают морфологическое состояние эпителия, его барьерную функцию, позволяют следить за восстановлением экосистемы. В настоящее время в нашей стране определены хроматографические критерии некоторых дисбиотических состояний, в основном у взрослых пациентов.

Достаточно перспективной является хромато-масс-спектрометрия с определением микробных маркеров. Главным преимуществом метода является возможность количественного определения более 170 таксонов клинически значимых микроорганизмов в различных средах организма. Существует возможность оценки изменений микрофлоры кишечника на основании результатов исследования микробных маркеров в крови. Метод позволяет не только оценить совокупность микробных популяций в целом, но и конкретно определить количественные диспропорции отдельных видов бактерий. Достаточно весомые клинические результаты

метод дает при детекции микробного сообщества в доступных локусах* организма или при исследовании биопсийного материала. Хотя концентрация бактериальных маркеров (структурных компонентов бактериальных клеток и метаболитов) в сыворотке крови коррелирует с концентрацией микробов на кишечной стенке, измеренной в биоптатах, тем не менее отражает совокупное влияние микроорганизмов, обитающих на всех слизистых оболочках человека (в ротоглотке, урогенитальном тракте), а также из очагов воспаления, вызванного индигенной микрофлорой или возбудителем, поступившим извне. Поэтому должны быть накоплены соответствующие клинические данные, позволяющие достоверно оценить клиническую значимость результатов метода.

Неинвазивным методом исследования при синдроме избыточного бактериального роста в тонкой кишке является определение водорода в выдыхаемом воздухе после нагрузки лактулозой или глюкозой, т. к. натощак концентрация водорода в выдыхаемом воздухе находится в прямой зависимости от выраженности бактериального обсеменения тонкой кишки. Этот метод недоступен для обследования детей грудного возраста, у которых основным метаболитом кишечной микрофлоры является лактоза, а также не рекомендован к применению в периоде клинической манифестации кишечных проявлений, т. к. нагрузка глюкозой может усугубить выраженность диареи, что особенно значимо у детей.

Известны косвенные методы диагностики дисбиоза, с определением различных маркеров в фекалиях: экспресс-анализ совокупной протеолитической активности условно патогенных бактерий, анализ активности Ig-протеаз, определение бета-литической активности, определение содержания антител иммуноглобулинов различных классов к липополисахариду грамотрицательных бактерий и др.. Разработка указанных тестов уже является свидетельством неудовлетворенности результатами классического бактериологического анализа. Эти методы невозможно использовать у детей грудного возраста в связи с возрастной незрелостью иммунной или ферментной систем, некоторые из них характеризуются недостаточной воспроизводимостью (35-60%). Поэтому они используются в качестве дополнительных к культуральным и маркируют отдельные негативные характеристики микрофлоры с вероятными патологическими свойствами.

В целом, несмотря на достаточное количество современных методик исследования микрофлоры, ни одна из них, используемая изолированно, не дает исчерпывающей информации о состоянии микрофлоры у конкретного пациента. Комбинация методов позволяет получить больше информации. Естественным ограничением для широкого применения достоверных методов диагностики является необходимость получения биоптатов слизистой кишечника. Поскольку более приемлемым для практики методом (особенно в детском возрасте) является исследование фекальной микрофлоры, которая полностью не отражает состояние мукозо-ассоцииро- ванных видов, необходимо расширять поиск клинических характеристик, соответствующих тем или иным микробиологическим данным. Последние следует дополнять оценкой функционального состояния кишечника на основе результатов другого доступного лабораторного обследования. Это позволит приблизиться к пониманию целостной картины патологических процессов, происходящих в ЖКТ, а значит, улучшить алгоритмы лечения.

Представляется, что в настоящее время наиболее эффективной и доступной для широкого применения следует признать комбинацию трех методов диагностики дисбиотических нарушений у конкретного пациента: классического бактериологического качественно-количественного, метода газожидкостной хроматографии с определением КЖК и копроци- тологического. Вместе с тем постоянное совершенствование диагностических методик и накопление научных данных о функционировании микрофлоры будут способствовать дальнейшей оптимизации диагностики дисбиотических нарушений.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка
      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...







      Наши продукты






















      © 2006–2018 ООО «МЦФЭР», медиагруппа «Актион-МЦФЭР»

      Журнал «Здравоохранение» –
      практический журнал для главного врача.

      Все права защищены. Полное или частичное копирование любых материалов сайта возможно только с письменного разрешения редакции журнала «Здравоохранение».
      Нарушение авторских прав влечет за собой ответственность в соответствии с законодательством РФ.

      Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
      Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать документ на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 12 000 статей
      — 8 000 ответов на вопросы
      — 200 видеосеминаров
      — готовые формы и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные сервисы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!


      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Скачать файл может только медицинский работник!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Изображение предназначено для медицинских работников!


      Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

      Читайте экспертные
      материалы

      Скачивайте готовые
      формы и СОПы

      Смотрите
      бесплатные вебинары

      13 000 статей

      1 500 инструкций

      200 записей

      Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×