ИГХ: методика, алгоритмы исследования, проблемы и способы их решения

988

Иммуногистохимические исследования (ИГХ) – это специфические методики выявления точного расположения того или иного тканевого или клеточного компонента на основе его связывания с мечеными антителами.

Активное развитие этого направления клинической диагностики на территории России некоторым образом связано с открытием новых методов в лечении лимфопролиферативных патологий.

Как правило, назначение пациентам дорогостоящих лекарственных препаратов связано с обязательной иммуногистохимической верификацией морфологического диагноза.

Опыт работы КДЛ, занимающихся диагностикой  заболеваний лимфоидной ткани в нашей стране, наглядно показывает отсутствие единых утвержденных стандартов работы и неудовлетворительное качество тестов.

Кроме того, нет единых сведений об общем количестве лабораторий, занимающихся иммуногистохимической диагностикой в Российской Федерации.

Однако все же решение существующих проблем есть – оно заключается, во-первых, в приостановке деятельности диагностических лабораторий, не прошедших тестирование на добровольной основе, и  выполнении ИГХ-исследований лимфом в референсных центрах, а во-вторых – в повышении качества методов проведения указанного анализа с учетом индивидуальных замечаний, комментариев и рекомендаций экспертов в каждой отдельно взятой лаборатории.

При этом стоит помнить, что качество иммуногистохимического исследования как такового зависит от ряда характеристик, часть которых является субъективными и связанными с опытом и уровнем профессионализма патоморфолога. 

Свежий номер журнала в подарок!

СКАЧАТЬ НОМЕР

Метод с биотин-авидиновым комплексом: описание, сущность, преимущества, недостатки

Особую диагностическую ценность иммуногистохимическое исследование приобретает в том случае, когда возникают определенные сложности в определении гистогенетической принадлежности ткани опухоли на основании анализа рутинных срезов, окрашенных гематоксилин-эозином. При этом часто используется термин «недифференцированная опухоль». Определение гистогенеза опухолевой ткани – необходимое условие для выбора тактики лечения и оценки прогноза.

В настоящее время ИГХ чаще всего используется для определения гемобластозов – опухолей лимфоидной ткани (лимфом) и кроветворной ткани (лейкозов). Конкретные панели антител дают возможность диагностирования острых и хронических лейкозов, лимфомы Ходжкина (лимфогранулематоза), а также различных неходжкинских лимфом.

Существует целый ряд иммуногистохимических исследований, однако наиболее распространенным является непрямое иммуноокрашивание с применением биотин-авидинового комплекса. Этот метод предполагает использование двух различных антител: первичных и вторичных.

Как должна оснащаться клинико-диагностическая лаборатория?

Как должна оснащаться клинико-диагностическая лаборатория?
посмотреть/скачать>>

Первичные и вторичные антитела

Первичные антитела вступают в реакцию с антигенами ткани. Вторичные антитела, связанные с меткой, взаимодействуют с первичными, которые являются для них антигеном.

Данный метод намного чувствительнее прямого иммуноокрашивания, так как с каждой молекулой первичных антител связываются несколько молекул помеченных вторичных антител.

Биотин, или витамин Н – это соединение, устойчивое к воздействию внешних факторов – высоких температур, щелочных и кислых сред, хорошо растворимое в воде и этаноле. Биотин является коферментом во многих реакциях присоединения, он легко соединяется с белками, ферментами и иммуноглобулинами.

Биотин-авидиновый комплекс чрезвычайно стоек и разрушается только при обработке высокими температурами, так как авидин чувствителен к их воздействию.

Авидин имеет четыре места связывания, к которым присоединяются белки или биотин. Таким образом, биотин-авидиновый комплекс используется в качестве своеобразного связующего моста между ферментами и белками, и, по сути, представляет собой комплекс из авидина и фермента, связанного с биотином.

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

Лабораторная диагностика

В нем три центра связывания авидина связаны с ферментом или флюорохромом через биотин. Четвертый центр связывания остается свободным.

Сам комплекс формируется в несколько этапов:

  • Первичные антитела связываются с антигеном;
  • Помеченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными;
  • Комплекс «биотин-авидин-фермент» связывается с биотином вторичных антител.

Таким образом, с одной молекулой антигена связываются три молекулы фермента. Этот метод получил название АВС-метода (Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase macromolecular Complex).

иммуногистохимический анализ АВС-метода

Рис. 1. Схема метода с биотин-авидиновым комплексом

Данный метод обладает рядом преимуществ:

  • использование вторичных антител существенно повышает чувствительность определения антигена;
  • возможность использования меньшего количества первичных антител;
  • проведение реакции занимает не более 3 часов;
  • готовый биотин-авидиновый комплекс допустимо использовать в течение нескольких суток.

Несмотря на все преимущества, метод с использованием биотин-авидинового комплекса не лишен своих недостатков, к которым относятся, в частности:

  • необходимость блокирования эндогенного биотина для недопущения его взаимодействия с авидином;
  • в ряде случаев эндогенный биотин может давать неспецифическое окрашивание («фон»), что может несколько затруднить обнаружение искомого антигена и определение его локализации.

Алгоритмы ИГХ-исследований опухолей различной природы

Алгоритмы ИГХ анализа

ИГХ: разновидности биомаркеров

Для ИГХ-исследования первичных опухолей и дочерних новообразований (метастазов) применяется широкий спектр биологических маркеров. В широком смысле биомаркер является показателем нормальных физиологических процессов, различных заболеваний, а также объективно оцененного и измеренного фармакологического ответа на то или иное вмешательство. 

Биологические маркеры делятся на:

  • цитоспецифичные (лейкоцитарные CD-антигены, миоглобин, тиреоглобулин, гладкомышечный актин и др.);
  • тканеспецифичные (компоненты базальной мембраны, рецепторы, белки промежуточных филаментов и др.);
  • маркеры пролиферации (Ki 67, PCNA);
  • антигены, ассоциированные с опухолевыми процессами (СА 153, СА125, СА 199);
  • маркеры опухоли и онкофетальные антигены (б-фетопротеин, раковоэмбриональный антиген);
  • ферменты, гормоны, белковые продукты клеточных онкогенов и др.

Онкоморфолог в своей повседневной деятельности ставит перед собой две основные задачи – выявление первичного новообразования и  оценка его злокачественного потенциала. Существенную помощь в их решении оказывают тканеспецифичные маркеры.

Тканеспецифичные маркеры

  • лимфома Ходжкина (лимфогранулематоз) – CD15, CD30;
  • гепатоцеллюлярная карцинома – α-фетопротеин, гепатоцитарный антиген;
  • гастроинтестинальные стромальные опухоли;
  • острый лимфобластный лейкоз, почечноклеточные опухоли – CD10 (CALLA):
  • рак предстательной железы – ПСА (простатспецифический антиген);
  • Т-клеточные лимфомы – CD3;
  • В-клеточные лимфомы – CD20;
  • меланома – HMB-45, тирозиназа, мелан А;
  • опухоли щитовидной железы – тиреоглобулин, кальцитонин, TTF-1;
  • опухоли легких – сурфактант, TTF-1;
  • опухоли молочных желез – ER, PR;
  • аденокарциномы (без уточнения локализации) – карциноэмбриональный антиген;
  • карциномы – цитокератины;
  • нейроглиальные опухоли – нейронспецифическая энолаза, глиальный фибриллярный кислый белок, синаптофизин;
  • мезотелиальные опухоли – кальретинин, мезотелин;
  • герминогенные опухоли – хорионический гонадотропин, PLAP.

Часто случается, что онколог, располагая анамнезом больного, результатами клинических исследований, настаивает на выполнении «усеченного» ИГХ-исследования, включающего в себя 2-3 ключевых маркера, положительная реакция на которые должна не только служить подтверждением диагноза, но и сэкономить материальные средства.

По этой причине очень важно знать, что иммуногистохимический анализ, являясь вспомогательным методом исследования, должен включать в себя как положительные, так и отрицательные результаты экспрессии маркеров.

Это позволяет исключить другие гипотезы. Особенно это касается метастазов опухолей без выявленной первичной локализации.

Патоморфологическое заключение, которое получает на руки врач-онколог, включает в себя перечисление маркеров с положительной экспрессией, затем – перечисление маркеров с отрицательной экспрессией, а также с общей оценкой пролиферативной активности.

Однако нужно признать, что сегодня результаты ИГХ для лечащих врачей являются «калейдоскопом» онкомаркеров (антитела одинаковые, а заключения каждый раз разные), а для патологоанатомов – «игра в бисер», в которой все подчинено причинно-следственным связям.          

Выбор антител для иммуногистохимического анализа

В процессе диагностики опухоли выбор антител может быть двояким – поэтапным с постепенным увеличением их спектра, либо сразу с применением широкой панели реагентов. В первом случае у нас получится сэкономить, однако будут повышены трудозатраты и длительность выполнения.

Во втором случае все получится с точностью наоборот – будет израсходовано большое число антител, в то время как для установления точного диагноза необходима лишь небольшая их часть.

Положительная реакция с виментином возникает при мизенхимальных опухолях (саркомы, лимфомы), меланоме и некоторых опухолях нейрогенной природы.

Алгоритм ИГХ анализа аденокарцином неясной первичной локализации 

Рис. 2. Алгоритм ИГХ анализа аденокарцином неясной первичной локализации

ИГХ анализ виментин-положительных новообразований

ИГХ анализ виментин-положительных новообразований

Алгоритм ИГХ анализа эпителиоидноклеточных опухолей

Алгоритм ИГХ анализа эпителиоидноклеточных опухолей

ИГХ анализ эпителоидноклеточных опухолей

Основные разновидности опухолей мягких тканей

Иммуногистохимический анализ опухолей мягких тканей имеет свои нюансы. Особенно это касается сарком. В ряде случаев диагноз может быть установлен и без ИГХ-исследования. В некоторых опухолях экспрессируются специфические антитела, однако зачастую приходится повторять анализ с самого начала (CD45RO, VIM, S-100, AE 1/3).

Заключение составляется на основе клинического протекания заболевания, морфологической картины образования на светооптическом уровне и результатов иммуногистохимии. При необходимости применяются вспомогательные методики цитогенетики и молекулярной генетики.

Условно опухоли мягких тканей подразделяются на:

  1. плеоморфные;
  2. эпилептоидноклеточные;
  3. мелкокруглоклеточные;
  4. веретеноклеточные.

Алгоритмы исследования каждого из перечисленных видов представлены на рисунках, в каждом из которых содержится обязательный этап исключения эпителиальной природы опухоли.

Анализ веретеноклеточных опухолей

Иммуногистохимический анализ: анализ веретеноклеточных опухолей

Иммуногистохимический анализ: основные проблемы методики, пути их решения

Основные технические проблемы методики ИГХ-исследования и возможные пути их преодоления приведены в Таблице 1.

Основные технические проблемы ИГХ метода и способы их решения

Таблица 1

Проблема

Возможная причина

Способы устранения

  1. Нет окрашивания в исследуемом и контрольном образцах
  • А. Антитела не работают из-за неправильного хранения
  • Б. Нарушена очередность этапов окрашивания
  • В. Инактивированные первичные антитела
  • Г. Несовместимость вторичных и первичных антител
  • Д. Несовместимость буфера для подготовки реагентов энзима и субстрат-хромогена
  • А. Увеличить концентрацию антител в рабочем разведении Избегать повторного размораживания антител
  • Б. Инкубация антител в правильном порядке Использование протокола
  • В. Использовать новую партию антител (старые выбросить)
  • Г. Вторичные антитела должны соответствовать первичным
  • Д. Сравнить совместимость, повторить окрашивание
  1. Нет окрашивания в исследуемом образце, при адекватном окрашивании в контрольном
  • А. Неправильная фиксация (образцы слишком долго фиксированы, вызывая «маскировку» антигена)
  • Б. Использование плохо фиксированных или нефиксированных тканей
  • В. Высыхание среза во время окрашивания
  • Г. Для выбранного ИГХ метода уровень детекции антигена крайне низкий
  • А. Протеолитическое переваривание трипсином
  • Б. Адекватная фиксация
  • В. Контроль влажности во время исследования
  • Г. Длительная инкубация с первичным антителом
  1. Слабое окрашивание
  • А. Очень короткое время инкубации либо низкая концентрация разведённых антител
  • Б. Срезы избыточно накапливают жидкость в буфере
  • А. Индивидуальный подбор титра антител и времени инкубации
  • Б. Вытереть излишки жидкости вокруг среза
  1. Избыточное фоновое окрашивание
  • А. Использование старых растворов
  • Б. Не подавлена активность эндогенной пероксидазы
  • В. Неправильное разведение антител
  • Г. Неспецифическое связывание с белками
  • Д. Избыточная инкубация с субстрат-хромогеном
  • Е. Срезы плохо промыты
  • Ж. Неполное удаление парафина
  • А. Приготовить свежий раствор
  • Б. Повторить окрашивание после 10 мин 3 % Н2О2
  • В. Использовать реагенты в большем разведении
  • Г. Использовать неимунную сыворотку того же животного
  • Д. Снизить время инкубации
  • Е. Промыть повторно
  • Ж. Повторная депарафинизация


Подписка на статьи

Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Живое общение с редакцией

А еще...


Мероприятия


Интервью

ФФОМС Наталья Стадченко

Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





Наши продукты




















© МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009


  • Мы в соцсетях
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×
Сайт предназначен для медицинских работников!

Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

— 9400 статей
— 4000 ответов на вопросы
— 80 видеосеминаров
— множество форм и образцов документов
— бесплатная правовая база
— полезные калькуляторы

Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт
Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль