Опыт применения масс-спектрометрии

54

Опыт применения масс-спектрометрии

В статье обсуждены варианты и приведены примеры взаимодействия практических бактериологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений и учреждений Роспотребнадзора с научно-методическим центром ФБУН ННИИЭМ им. академика И. Н. Блохиной по использованию высокотехнологичного оборудования для решения текущих практических задач лабораторной службы и методы идентификации микроорганизмов. 

При расследовании вспышек:

  • острых кишечных инфекций (ОКИ),
  • пищевых токсикоинфекций (ПТИ),
  • инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), и прочих инфекций бактериальной этиологии 

«золотым стандартом» является классический бактериологический метод, но современные методы идентификации микроорганизмов намного технологичней, требуют меньше времени для получения результата, могут быть стандартизованы.

Арсенал современных методов бактериологических исследований 

«культурально-независимые» методы 

позволяющие проводить индикацию и идентификацию микроорганизмов в нативном (исходном) материале, исключая этап выделения чистой культуры, — это хорошо известные и широко используемые в лабораторной практике для выявления ДНК бактерий методы амплификации нуклеиновых кислот, в т. ч. ПЦР, а также методы иммуноферментного анализа для определения антигенов и методы определения относительного изменения электрического сопротивления среды, происходящего под влиянием процессов роста жизнедеятельности микроорганизмов, реализованные в различных автоматических анализаторах,

«культурально-зависимые» методы идентификации микроорганизмов 

позволяющие получить результаты идентификации патогенов из чистой культуры, но в более короткие сроки, чем классическая бактериология.

Методика масс-спектрометрии с 2011 г. внесена в реестр медицинских технологий, программное обеспечение сертифицировано, а  масс-спектрометры имеют регистрационное удостоверение о внесении приборов в государственный реестр изделий медицинской техники и сертификаты Госстандарта России об утверждении средств измерений.

К сожалению, расходные материалы для различных анализаторов и сами приборы стоят довольно дорого, что не позволяет приобретать их для широкого использования в рутинной работе бактериологических лабораторий.

Применение современных методов

В то же время в практике часто возникают ситуации, когда применение современных методов бывает просто необходимо.

В таких случаях практическим лабораториям целесообразно обращаться за помощью в  научно-методические центры, оснащенные современным высокотехнологичным оборудованием и укомплектованные высококвалифицированным персоналом.

В Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И. Н. Блохиной Роспотребнадзора организован Региональный научно-методический центр по мониторингу за актуальными для ПФО инфекционными болезнями, оснащенный современным высокотехнологичным масс-спектрометром с программным обеспечением, позволяющим осуществлять быструю и точную видовую идентификацию широкого спектра грамотрицательных, грамположительных, спорообразующих бактерий, дрожжеподобных грибов и плесеней.

Важно! В качестве примера «культурально-зависимых» методов можно назвать реализованную в автоматических анализаторах детекцию развития культур в присутствии различных химических тест-субстратов с использованием турбидиметрии или колориметрии, а также метод масс-спектрометрии, который стал использоваться для идентификации микроорганизмов относительно недавно.

Методы идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии основан на принципе, сходном с методом установления личности по отпечаткам пальца, — методом фингерпринта.

После ионизации образца под воздействием лазера и детекции всех образовавшихся ионов получается уникальный масс-спектр, который сравнивается с имеющимися в базе данных референсными масс-спектрами микроорганизмов различных видов. По максимально совпадающим масс-спектрам проводится определение вида исследуемого микроорганизма.

Как организовать микробиологический контроль

Как организовать микробиологический контроль
посмотреть/скачать>>

О достоверности идентификации судят по значению коэффициента совпадения (Score values):

  • 2,000–3,000 — идентификация до вида,
  • 1,999–1,700 — идентификация до рода,
  • 1,699–0 — идентификация не прошла и значению категорий:
  1. А — достоверная идентификация до вида,
  2. В — достоверная идентификация до рода,
  3. С — недостоверный результат.

Поставляемая производителем база данных содержит около 6000 референсных масс-спектров различных видов микроорганизмов, поэтому практически любой бактериальный патоген, выделенный из биологического материала больных, из продуктов питания или внешней среды, можно идентифицировать до вида в течение нескольких минут.

При сравнении полученных масс-спектров можно выявить не только родовые и видовые отличия (рис. 1А), но и отличия штаммов (рис 1Б)

Отличие штаммов

Иерархическая структура спектров рибосомальных белков микроорганизмов рода Klebsiella, различия видовые (А) и штаммовые (Б)

Масс-спектры одного и того же штамма K.pneumoniae 80, выделенного в разное время, через разное количество пассажей на питательной среде, образуют один кластер, не демонстрируя видимых различий. В то же время этот штамм отличается от других штаммов данного вида (рис. 1Б).

Программное обеспечение масс-спектрометра позволяет создавать собственные базы данных, содержащие масс-спектры штаммов микроорганизмов, выделяющихся в конкретном регионе (области, районе, больнице и т. п.), что в свою очередь позволяет осуществлять динамичное наблюдение за их циркуляцией и оценивать эффективность проводимых противоэпидемических мероприятий. Это особенно важно при обнаружении госпитальных штаммов.

При расследовании случая ухудшения состояния новорожденных из отделения реанимации детской больницы, произошедшего на фоне проводимой базовой терапии, из смывов и биологического материала детей были выделены грамотрицательные микроорганизмы, идентифицированные методом масс-спектрометрии как Elizabethkingea meningosepticum и Burkcholderia cepacia (Score 2,215–2,196 и 2,4–2,012 соответственно).

После коррекции базовой терапии состояние детей стабилизировали, в результате проведенных санитарно-гигиенических мероприятий было предотвращено распространение ИСМП.

Также в качестве примера можно привести следующий случай: в бактериологической лаборатории одной из больниц города из ликвора поступившего с симптомами менингита пациента была выделена чистая культура грамположительных неспорообразующих палочек, которую доставили в ФБУН ННИИЭМ им. академика И. Н. Блохиной Роспотребнадзора для экспресс-идентификации методом масс-спектрометрии. Процедура идентификации микроорганизмов методом прямого нанесения с частичной экстракцией на мишени заняла около десяти минут.

Культура была идентифицирована как Listeria monocytogenes. Достоверность идентификации обеспечивалась трехкратным нанесением образца на мишень. Получение одинакового результата с высоким коэффициентом совпадения Score от 2,310 до 2,197 в трех точках свидетельствовало о надежности видовой идентификации.

Быстрое установление этиологического фактора позволило в тот же день назначить пациенту адекватную антибактериальную терапию.

Таким образом, при неудачной в силу ряда причин идентификации какого-либо микроорганизма сомнений в полученных с помощью других методов результатах идентификации, отсутствии необходимых для идентификации редко используемых дифференциально-диагностических питательных сред или наборов реагентов, а также в случае необходимости срочной экспресс-идентификации выделенных микроорганизмов практическим лабораториям целесообразно обратиться за помощью в  научно-методический центр, имеющий необходимое оборудование.

Второй вариант взаимодействия

Второй вариант взаимодействия практических лабораторий и  научно-методических центров — это характеристика и подтверждение биологических свойств штаммов микроорганизмов для контроля качества питательных сред.

В документах, регламентирующих контроль качества питательных сред, в частности в ГОСТ ISO/TS 11133-1-2014 и МУК 4.2.2316–08, предлагается использовать широко доступные коллекционные эталонные штаммы, однако не исключается возможность использования и выделенных в лаборатории культур, при условии, что эти штаммы тщательно охарактеризованы, их культуральные характеристики хорошо изучены и подтверждены в лаборатории более высокого ранга.

Кроме того, в контрольном наборе должен находиться штамм с атипичными характеристиками (слабо растущие или биохимически неактивные штаммы) — в данном случае для документального подтверждения правильности видовой идентификации также целесообразно прибегнуть к помощи научно-методического центра, обладающего соответствующим оснащением.

Третий вариант взаимодействия

Третий вариант взаимодействия — привлечение научно-методических центров, оснащенных высокопроизводительным наукоемким оборудованием для расследований случаев заболеваний ПТИ, ОКИ, ИСМП в период эпиднеблагополучия и вспышек: экспресс-идентификация методом масс-спектрометрии большого объема выделенных штаммов микроорганизмов в короткий срок позволит более качественно провести дальнейшее расследование по выявлению этиологического фактора заболеваний, а также составить дендрограммы, иллюстрирующие взаимосвязь выделяемых микроорганизмов на основе сходства масс-спектров рибосомальных белков.

В качестве иллюстрации можно привести расследование вспышки пищевой токсикоинфекции, произошедшей в детском оздоровительном лагере. В практическую лабораторию Роспотребнадзора был доставлен собранный в детском лагере материал: смывы, пробы пищевых продуктов, мазки из носа персонала, рвотные массы одного из заболевших детей - всего 27 образцов.

Из 12 образцов в ходе классического бактериологического исследования (посев на хромогенной среде) был выделен S.aureus. Выделенные штаммы были переданы во ФБУН ННИИЭМ им. академика И. Н. Блохиной Роспотребнадзора.

Таксономическая принадлежность штаммов была также подтверждена методом масс-спектрометрии. На основе полученных масс-спектров была составлена предварительная дендрограмма, отражающая сходство профилей рибосомальных белков исследованных штаммов.

В качестве контрольных штаммов были использованы два штамма золотистого стафилококка, выделенных из фекальной микрофлоры людей, не имеющих отношения к данной вспышке.

По предварительной дендрограмме можно было судить только о том, что штаммы, выделенные при расследовании вспышки, образуют самостоятельный кластер, т. е. схожи по своим свойствам. Для получения более детальной информации в данном случае 12-ти штаммов было явно недостаточно.

Далее в анализ были добавлены штаммы S.aureus, выделенные от заболевших в лагере детей, госпитализированных в инфекционную больницу города.

В результате была получена следующая дендрограмма 

Рибосомальные белки

Рис. 2. Иерархическая структура спектров рибосомальных белков штаммов S.aureus, выделенных при расследовании вспышки ПТИ в детском оздоровительном лагере

На рисунке видно, что один из контрольных штаммов и штамм, выделенный из рвотных масс одного из детей, образуют отдельный кластер, и, по-видимому, этот штамм не играет большой роли в возникновении данной вспышки пищевой токсикоинфекции.

Основной массив штаммов, выделенных при расследовании данного случая, образует самостоятельный кластер, подразделяющийся на три подкластера. Один из подкластеров объединяет штаммы, выделенные из назального мазка одного из поваров и из смывов с объектов внешней среды. А два подкластера замыкаются на штаммы, выделенные из носа второго повара.

Один из этих подкластеров образует штаммы, выделенные из продуктов питания и смывов. Второй подкластер объединяет штаммы, выделенные от больных и из смывов с объектов внешней среды туалетных комнат.

Таким образом, в результате анализа обнаружено, что в назальной микрофлоре обоих поваров присутствуют золотистые стафилококки со сходными биологическими свойствами. Методы идентификации микроорганизмов в возникновении и развитии вспышки большее значение имеет штамм, выделенный из назального мазка второго повара, т. е. второго повара можно рассматривать как источник инфекции.

В то же время следует обратить внимание на то, что полученные при данном анализе результаты неправомерно использовать в качестве единственного критерия при установлении источника инфекции и путей распространения вспышки. Только оценив всю совокупность данных, полученных при эпидемиологическом расследовании, можно делать соответствующие выводы.

Иллюстрацией к данному положению может служить пример расследования другого случая пищевой токсикоинфекции. После обеда в одном из кафе города в инфекционную больницу обратились с признаками гастроэнтерита несколько пациентов, что инициировало проведение проверки данного заведения службой Роспотребнадзора.

В бактериологическую лабораторию были доставлены образцы блюд, приготовленных в кафе, назальные и оральные мазки персонала и биоматериал двух заболевших. В пробах мясных тефтелей было выявлено наличие S.aureus только при использовании бактериологического анализатора.

Из части образцов биологического материала на плотных питательных средах также удалось выделить штаммы S.aureus, их доставили во ФБУН ННИИЭМ для анализа на  масс-спектрометре.

В результате проведенного анализа была получена следующая дендрограмма

Биологический материал

Рис. 3. Иерархическая структура спектров рибосомальных белков штаммов S.aureus, выделенных при расследовании вспышки ПТИ в кафе

В качестве контрольного также использовался штамм, не имеющий отношения к данной вспышке.

Полученные в результате исследования масс-спектры образуют два кластера, в один из которых вошли масс-спектры штаммов, выделенных из назальных мазков менеджеров и  шеф-бармена. Штаммы, образующие данный кластер, по своим свойствам довольно далеки от остальной группы.

Второй кластер образуют масс-спектры штаммов, полученных от поваров, су-шефов, официантов и больных. Причем наиболее близкими по своим свойствам к штаммам, полученным от больных, являются штаммы, выявленные у персонала двух поварских бригад.

При анализе данных по вспышке выяснилось, что мясные тефтели были приготовлены за сутки до начала вспышки бригадой № 1. Следовательно, наиболее вероятной причиной возникновения вспышки является обсеменение мясного продукта штаммами стафилококка назальной и оральной флоры поварской бригады № 1, что подтверждается результатами анализа сходства масс-спектров данных штаммов.

Таким образом, приведенные в статье результаты исследований доказывают высокую эффективность использования масс-спектрометрии для решения текущих задач в работе клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений и бактериологических лабораторий Роспотребнадзора.

Статья из журнала "Справочник заведующего КДЛ" № 11, 2015

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×