Первый случай выявления фенотипа Rhnull системы Резус в России

31

Первый случай выявления фенотипаФенотип Rhnull характеризуется отсутствием всех антигенов системы Резус на поверхности эритроцитов.

Принято выделять фенотип Rhnull регуляторного и аморфного типов.

В статье описан случай выявления фенотипа Rhnull регуляторного типа у пациентки А., страдающей менингиомой головного мозга.

Серологическими методами исследования показано отсутствие всех антигенов системы Резус на эритроцитах, но молекулярными методами продемонстрировано наличие генов RHD и RHCE.

Такое сочетание характерно для фенотипа Rhnull регуляторного типа.

Антигены системы резус и аллоиммунизация к их отсутствию делает невозможным переливание донорских эритроцитсодержащих сред данной больной так же, как и всем людям с данным фенотипом показаны только аутогемотрансфузии.

Приведены литературные сведения о молекулярных основах появления фенотипа Rhnull регуляторного и аморфного типов.

Среди выявленных в настоящее время 33 групповых эритроцитарных систем самой полиморфной является система Резус. Она включает 59 антигенов и более 200 аллелей. Антигены системы Резус кодируются двумя генами − RHD и RHCE, расположенными на коротком плече хромосомы 1 (1p34. 3-1p36.1) и имеющими 10 экзонов. Гены RHD и RHCE определяют биосинтез полипептидов Rh с молекулярной массой 30–32 kDa, состоящих из 417 аминокислот.

Гидрофобные белки пронизывают мембрану эритроцита в 12 местах, образуя 6 петель, состоящих из внеклеточной, внутримембранной и внутриклеточной частей  и имеющих внутримембранные N- и  C-концевые последовательности. Ген RHD кодирует синтез антигена D, ген RHCE — антигены С/с и  Е/е.

Опыт централизации лабораторной службы

Опыт централизации лабораторной службы
посмотреть/скачать>>

Антигены системы Резус с белками Rh, могут экспрессироваться только при условии присутствия на мембране эритроцитов другого белка — Rh-ассоциированного гликопротеина (RhAG, Rh50), являющегося продуктом гена RHAG, расположенного на хромосоме 6 ( 6p11-p21). Вместе они представляют семейство резусных белков, входящих в большой резусный комплекс, включающий дополнительные гликопротеины: CD47, гликофорины, А и B, гликопротеины антигенных систем LW и Duffy (Fy5), белок Band 3.

Доказано, что RhAG представляет собой обязательный посттранскрипционный фактор, влияющий на экспрессию резусных белков. Гликопротеин RhAG необходим для транспортировки Rh-белков к эритроцитарной мембране, хотя сам RhAG может интегрироваться в мембрану эритроцита без непосредственного участия резусных протеинов.

Однако для оптимальной транспортировки и сборки резусного комплекса необходимы все белки Rh, играющие роль стабилизатора всего комплекса за счет взаимодействия с некоторыми компонентами скелета мембраны эритроцитов. Для нормального взаимодействия белков RhAG и Rh необходимы как С-, так и  N-концевые последовательности белков Rh.

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

Резус-дефицитный фенотип

Нарушение связей между ними также приводит к отсутствию синтеза самих резусных протеинов и формированию резус-дефицитных фенотипов. Примером может служить так называемый фенотип Rhnull, при котором на эритроцитах отсутствуют все антигены системы Резус.

Существуют две генетические причины появления данного фенотипа, касающиеся изменений исключительно в генах RH и RHAG.

Аморфный тип 

  • Аморфный тип Rhnull является следствием делеции гена RHD и появления гомозиготности по молчащим аллелям в локусе RHиз-за мутаций в гене RHCE (делеция двух нуклеотидов в кодонах 322 и 323 седьмого экзона и замена нуклеотидов ТСА на С), приводящих к разрыву рамки считывания генетического материала. Синтезированный на основе такого транскрипта потенциальный белок состоял из 398 вместо 417 аминокислот и имел 10 вместо 12 трансмембранных цепей. Другой причиной появления аморфного типа Rhnull может быть мутация в интроне 4 — замена T на G на границе с экзоном 4, которая приводит к активации трех скрытых сплайсинговых сайта.

Из них два генерируют транскрипты, присоединяемые к нуклеотидам 16 и 11 интрона 4, что приводит к появлению стоп-кодонов в экзонах 7 и 5 соответственно. Активация третьего скрытого сплайсингового сайта приводит к появлению транскрипта, который способствует делеции последнего шестого нуклеотида в экзоне 4 и формированию стоп-кодона.

Huang C.H. с соавторами также описали мутации, приводящие к делеции экзонов 4 и 5 в гене RHCE. Феномен аморфного типа Rhnull ассоциирован с отсутствием или снижением экспрессии иных гликопротеинов (RhAG, CD47, LW, гликофорины A и B), входящих в гетерополимерный резусный комплекс.

Регуляторный тип

  • Регуляторный тип фенотипа Rhnull встречается чаще, чем аморфный, и является следствием гомозиготности по супрессорному мутантному аллелю гена RHAG, подавляющему экспрессию на мембране эритроцитов антигенов Rh. Все мутации в гене RHAG, приводящие к сдвигу рамки считывания (сплайсинговые или несмысловые мутации), приводят к незавершенной или поздней конечной трансляции белковой молекулы.

Такой же эффект имеют и несмысловые мутации, приводящие к замене единичных аминокислот в протеине RhAG.

Иными словами, любые мутации в гене RHAG приводят к синтезу неполноценного протеина, неспособного формировать функционирующий комплекс с белковой молекулой системы Резус. Лица с фенотипом Rhnull регуляторного типа передают своему потомству нормально функционирующие гены системы Резус, поскольку сами гены RHD и RHCE не повреждены. Описан случай полной делеции гена RHAG, что привело к формированию Rhnull фенотипа.

Новые требования к закупкам иностранных медицинских изделий

Новые требования к закупкам иностранных медицинских изделий
посмотреть/скачать>>

К регуляторному Rhnull фенотипу относят фенотип Rhmod. Первоначально предполагали, что экспрессия антигена D сильно угнетена вследствие гомозиготности по супрессорному гену XQ, расположенному на аутосомной хромосоме, не связанной с хромосомой 1. Позже было установлено, что различные нуклеотидные замены в гене RHAG являются ответственными за повреждение белка RhAG.

Описан вариант фенотипа Rhmod, при котором в белковой молекуле имеется единственная замена аминокислоты серина на аспарагин в позиции 79 и отмечается снижение количества молекул на эритроците. Сами гены RHD и RHCE не повреждены, но на эритроцитарной мембране присутствует малое количество Rh протеинов, выявляемых только в методах адсорбции-элюции, не применяемых в рутинной практике (ложный D-отрицательный фенотип).

Важно! Резусные белки, являясь составной частью эритроцитарной мембраны, необходимы для нормального обмена электролитов. При их отсутствии повреждено распределение мембранных фосфолипидов, что приводит к морфологическим и функциональным изменениям эритроцитов, описанным как резус-дефицитный синдром.

Характерными признаками его являются стоматоцитоз и сфероцитоз, сниженная осмотическая резистентность и увеличенная ионная проницаемость эритроцитов. Как следствие, больные с фенотипом Rhnull часто страдают хронической гемолитической анемией.

Редкий фенотип Rhnull регуляторного типа 

Впервые за многолетнюю работу лаборатории иммуногематологии (c 1963 года) нам удалось выявить редкий фенотип Rhnull регуляторного типа у больной A., 68 лет, с менингиомой головного мозга. Больная была оперирована в НИИ им.  Н. В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы.

Известно, что менингиома часто сопровождается многочисленными хромосомными нарушениями в ткани опухоли: потерей гетерозиготности на хромосомах 1р36, 6q, 14q, 18q, 22q и иных.

В клиническом анализе крови больной А. эритроцитарные параметры отклонений не имели (Hb 154 г/л, эритроциты 5,16×1012, гематокрит (HCT) 42,7%, средний объем эритроцита (MCV) 82,8 мкм3, среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) 29,8 пг, средняя концентрация гемоглобина в одном эритроците (MCHС) 361 г/л, коэффициент вариации объема эритроцитов (RDW) 14,5%).

У больной в анамнезе было 4 беременности (1 роды, 2 аборта, 1 внематочная беременность). Приводим результаты лабораторного обследования пациентки.

Фенотипирование эритроцитов по системе АВО и Резус выполняли при использовании реакции агглютинации на планшетах для серологических исследований Цоликлонами IgM класса со специфичностями анти-А и  анти-В, анти-D, анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е, анти-е производства ООО «Гематолог» (Москва) и в гелевых картах DiaClon ABO/D Reverse Grouping, DiaClon Rh-Subgroups фирмы BioRad (США).

Определение полных антиэритроцитарных антител проводили в реакции солевой агглютинации в  96-луночных планшетах для иммунологических реакций, неполных антител — в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса) в пробирках и гелевых картах Liss/Coombs со стандартными эритроцитами фенотипов CCwDee К-, ccDEE К-, ccdee К скрининговой панели и идентификационной панели ( 11-клеточная) фирмы BioRad.

Контроль аутоагглютинации проводили между собственными эритроцитами и сывороткой больной (отрицательный контроль). Определение антигенов M и N проводили при использовании реакции агглютинации на плоскости с моноклональными антителами анти-М и  анти-N фирмы «Гематолог» (Москва). ЭРИТРОТЕСТТМ-Цоликлоны Анти-S, -s, -P1, -Lea, -Leb применяли для выявления соответствующих антигенов с помощью прямой реакции агглютинации в пробирках, а препараты ЭРИТРОТЕСТТМ-Цоликлон Анти-Fya и ЭРИТРОТЕСТТМАнти-Fyb использовали для определения соответствующих антигенов методом непрямой реакции агглютинации в пробирках по методикам производителя («Гематолог», Москва).

Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы BAG (Германия) по методике производителя. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала концентрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяемая по отношению показателей при 260 нм и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6–1,8, а концентрация конечной ДНК — 50–100 нг/мкл.

Для выявления мутаций применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании праймера для выявления генотипов системы АВО ( ABO-TYPE) и Резус ( RH-TYPE) производства фирмы «BAG» (Германия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1 мкг/мл) в TBE буфере при напряженности электрического поля 10–15 В/см. В лунки геля вносили по 10 мкл амплификационной смеси.

Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете (λ = 310 нм) при помощи трансиллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос амплификации внутреннего положительного контроля свидетельствовало о корректности проведенной ПЦР.

Согласно проведенным исследованиям, группа крови больной системы АВО была идентифицирована как Оαβ D- (фотография 1). Молекулярные методы подтвердили наличие генотипа O1O1. Проведенное определение фенотипа эритроцитов с помощью моноклональных антител специфичностей анти-D, -C, -Cw, -c, -E, -e на плоскости (фотография 2) и в гелевых картах (фотография 3) для выявления резусного фенотипа выявило отсутствие всех антигенов системы Резус (фенотип -/- или Rhnull).

Молекулярным методом выявлен генотип CcDee, что указывало на отсутствие повреждения генов локусов RHD и RHCE (фотография 4). Все вместе взятое позволило высказать предположение о наличии регуляторного типа фенотипа Rhnull.

Фенотип Rhnull системы Резус

Результаты исследования эритроцитов больной Ав-н в гелевых картах DiaClon ABO/D Reverse Grouping (фирма BioRad, США)

Пример исследования

Результаты фенотипирования эритроцитов больной Ав-н по системам Резус, MN, Kell с помощью цоликлонов фирмы «Гематолог» (Москва)

Результаты исследовния эритроцитов

Результаты фенотипирования эритроцитов больной Ав-н в гелевых картах DiaClon Rh-Subgroups (фирма BioRad, США) 

Элекртофореграмма продуктов

Результат генотипирования больной Ав-н. Электрофореграмма продуктов амплификации ПЦР при использовании праймеров RH-TYPE производства фирмы BAG (Германия) — CcDee

На эритроцитах присутствовали антигены систем Kell, Duffy, Lewis, Р, Kidd, MNS: фенотип был определен как K−k, Fy(а b−), Le(a−b), P1, Jk(a b−), M−N S−s.

Антиэритроцитарные антитела IgM класса в сыворотке крови больной отсутствовали. При постановке непрямой пробы Кумбса в гелевых картах сыворотка крови агглютинировала все образцы стандартных эритроцитов (реакцию оценивали на 3) скрининговой и идентификационной панелей (фотография 5), но не реагировала с собственными эритроцитами.

Непрямая проба Кумбса в классической постановке с теми же эритроцитами была отрицательной. Полученные результаты мы трактовали как присутствие антирезусных антител IgG класса низкой авидности.

Идентификационная панель

Результаты исследования неполных антител в сыворотке больной Ав-н со стандартными эритроцитами идентификационной панели фирмы BioRad

Известно, что трансфузии эритроцитсодержащих сред больным с фенотипом Rhnull представляют большие проблемы. Из-за отсутствия всех антигенов системы Резус такие больные будут подвержены риску аллоиммунизации при попадании в их организм полноценных аллогенных эритроцитов.

Единственным возможным подходом к заместительной терапии является заготовка и переливания собственных эритроцитов (аутогемотрансфузии).

Статья из журнала "Справочник заведующего КДЛ" № 11, 2015

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»

    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...


      Интервью

      ФФОМС Наталья Стадченко

      Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

      Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





      Наши продукты




















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль