text

🍁 Осенний ценопад: скидка 20%! УСПЕТЬ ➤➤➤

Портал для медицинских работников

Первый случай выявления фенотипа Rhnull системы Резус в России

  • 4 июля 2017
  • 188

Первый случай выявления фенотипаФенотип Rhnull характеризуется отсутствием всех антигенов системы Резус на поверхности эритроцитов.

Принято выделять фенотип Rhnull регуляторного и аморфного типов.

Внимание! Для скачивания доступна новая книга:  «Молекулярно-биологические исследования» ,

В статье описан случай выявления фенотипа Rhnull регуляторного типа у пациентки А., страдающей менингиомой головного мозга.

Серологическими методами исследования показано отсутствие всех антигенов системы Резус на эритроцитах, но молекулярными методами продемонстрировано наличие генов RHD и RHCE.

Такое сочетание характерно для фенотипа Rhnull регуляторного типа.

Антигены системы резус и аллоиммунизация к их отсутствию делает невозможным переливание донорских эритроцитсодержащих сред данной больной так же, как и всем людям с данным фенотипом показаны только аутогемотрансфузии.

Приведены литературные сведения о молекулярных основах появления фенотипа Rhnull регуляторного и аморфного типов.

Среди выявленных в настоящее время 33 групповых эритроцитарных систем самой полиморфной является система Резус. Она включает 59 антигенов и более 200 аллелей. Антигены системы Резус кодируются двумя генами − RHD и RHCE, расположенными на коротком плече хромосомы 1 (1p34. 3-1p36.1) и имеющими 10 экзонов. Гены RHD и RHCE определяют биосинтез полипептидов Rh с молекулярной массой 30–32 kDa, состоящих из 417 аминокислот.

Гидрофобные белки пронизывают мембрану эритроцита в 12 местах, образуя 6 петель, состоящих из внеклеточной, внутримембранной и внутриклеточной частей  и имеющих внутримембранные N- и  C-концевые последовательности. Ген RHD кодирует синтез антигена D, ген RHCE — антигены С/с и  Е/е.

Опыт централизации лабораторной службы

Опыт централизации лабораторной службы
посмотреть/скачать>>

Антигены системы Резус с белками Rh, могут экспрессироваться только при условии присутствия на мембране эритроцитов другого белка — Rh-ассоциированного гликопротеина (RhAG, Rh50), являющегося продуктом гена RHAG, расположенного на хромосоме 6 ( 6p11-p21). Вместе они представляют семейство резусных белков, входящих в большой резусный комплекс, включающий дополнительные гликопротеины: CD47, гликофорины, А и B, гликопротеины антигенных систем LW и Duffy (Fy5), белок Band 3.

Доказано, что RhAG представляет собой обязательный посттранскрипционный фактор, влияющий на экспрессию резусных белков. Гликопротеин RhAG необходим для транспортировки Rh-белков к эритроцитарной мембране, хотя сам RhAG может интегрироваться в мембрану эритроцита без непосредственного участия резусных протеинов.

Однако для оптимальной транспортировки и сборки резусного комплекса необходимы все белки Rh, играющие роль стабилизатора всего комплекса за счет взаимодействия с некоторыми компонентами скелета мембраны эритроцитов. Для нормального взаимодействия белков RhAG и Rh необходимы как С-, так и  N-концевые последовательности белков Rh.


Резус-дефицитный фенотип

Нарушение связей между ними также приводит к отсутствию синтеза самих резусных протеинов и формированию резус-дефицитных фенотипов. Примером может служить так называемый фенотип Rhnull, при котором на эритроцитах отсутствуют все антигены системы Резус.

Существуют две генетические причины появления данного фенотипа, касающиеся изменений исключительно в генах RH и RHAG.

Аморфный тип 

  • Аморфный тип Rhnull является следствием делеции гена RHD и появления гомозиготности по молчащим аллелям в локусе RHиз-за мутаций в гене RHCE (делеция двух нуклеотидов в кодонах 322 и 323 седьмого экзона и замена нуклеотидов ТСА на С), приводящих к разрыву рамки считывания генетического материала. Синтезированный на основе такого транскрипта потенциальный белок состоял из 398 вместо 417 аминокислот и имел 10 вместо 12 трансмембранных цепей. Другой причиной появления аморфного типа Rhnull может быть мутация в интроне 4 — замена T на G на границе с экзоном 4, которая приводит к активации трех скрытых сплайсинговых сайта.

Из них два генерируют транскрипты, присоединяемые к нуклеотидам 16 и 11 интрона 4, что приводит к появлению стоп-кодонов в экзонах 7 и 5 соответственно. Активация третьего скрытого сплайсингового сайта приводит к появлению транскрипта, который способствует делеции последнего шестого нуклеотида в экзоне 4 и формированию стоп-кодона.

Huang C.H. с соавторами также описали мутации, приводящие к делеции экзонов 4 и 5 в гене RHCE. Феномен аморфного типа Rhnull ассоциирован с отсутствием или снижением экспрессии иных гликопротеинов (RhAG, CD47, LW, гликофорины A и B), входящих в гетерополимерный резусный комплекс.

Регуляторный тип

  • Регуляторный тип фенотипа Rhnull встречается чаще, чем аморфный, и является следствием гомозиготности по супрессорному мутантному аллелю гена RHAG, подавляющему экспрессию на мембране эритроцитов антигенов Rh. Все мутации в гене RHAG, приводящие к сдвигу рамки считывания (сплайсинговые или несмысловые мутации), приводят к незавершенной или поздней конечной трансляции белковой молекулы.

Такой же эффект имеют и несмысловые мутации, приводящие к замене единичных аминокислот в протеине RhAG.

Иными словами, любые мутации в гене RHAG приводят к синтезу неполноценного протеина, неспособного формировать функционирующий комплекс с белковой молекулой системы Резус. Лица с фенотипом Rhnull регуляторного типа передают своему потомству нормально функционирующие гены системы Резус, поскольку сами гены RHD и RHCE не повреждены. Описан случай полной делеции гена RHAG, что привело к формированию Rhnull фенотипа.

Новые требования к закупкам иностранных медицинских изделий

Новые требования к закупкам иностранных медицинских изделий
посмотреть/скачать>>

К регуляторному Rhnull фенотипу относят фенотип Rhmod. Первоначально предполагали, что экспрессия антигена D сильно угнетена вследствие гомозиготности по супрессорному гену XQ, расположенному на аутосомной хромосоме, не связанной с хромосомой 1. Позже было установлено, что различные нуклеотидные замены в гене RHAG являются ответственными за повреждение белка RhAG.

Описан вариант фенотипа Rhmod, при котором в белковой молекуле имеется единственная замена аминокислоты серина на аспарагин в позиции 79 и отмечается снижение количества молекул на эритроците. Сами гены RHD и RHCE не повреждены, но на эритроцитарной мембране присутствует малое количество Rh протеинов, выявляемых только в методах адсорбции-элюции, не применяемых в рутинной практике (ложный D-отрицательный фенотип).

Важно! Резусные белки, являясь составной частью эритроцитарной мембраны, необходимы для нормального обмена электролитов. При их отсутствии повреждено распределение мембранных фосфолипидов, что приводит к морфологическим и функциональным изменениям эритроцитов, описанным как резус-дефицитный синдром.

Характерными признаками его являются стоматоцитоз и сфероцитоз, сниженная осмотическая резистентность и увеличенная ионная проницаемость эритроцитов. Как следствие, больные с фенотипом Rhnull часто страдают хронической гемолитической анемией.

Редкий фенотип Rhnull регуляторного типа 

Впервые за многолетнюю работу лаборатории иммуногематологии (c 1963 года) нам удалось выявить редкий фенотип Rhnull регуляторного типа у больной A., 68 лет, с менингиомой головного мозга. Больная была оперирована в НИИ им.  Н. В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы.

Известно, что менингиома часто сопровождается многочисленными хромосомными нарушениями в ткани опухоли: потерей гетерозиготности на хромосомах 1р36, 6q, 14q, 18q, 22q и иных.

В клиническом анализе крови больной А. эритроцитарные параметры отклонений не имели (Hb 154 г/л, эритроциты 5,16×1012, гематокрит (HCT) 42,7%, средний объем эритроцита (MCV) 82,8 мкм3, среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) 29,8 пг, средняя концентрация гемоглобина в одном эритроците (MCHС) 361 г/л, коэффициент вариации объема эритроцитов (RDW) 14,5%).

У больной в анамнезе было 4 беременности (1 роды, 2 аборта, 1 внематочная беременность). Приводим результаты лабораторного обследования пациентки.

Фенотипирование эритроцитов по системе АВО и Резус выполняли при использовании реакции агглютинации на планшетах для серологических исследований Цоликлонами IgM класса со специфичностями анти-А и  анти-В, анти-D, анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е, анти-е производства ООО «Гематолог» (Москва) и в гелевых картах DiaClon ABO/D Reverse Grouping, DiaClon Rh-Subgroups фирмы BioRad (США).

Определение полных антиэритроцитарных антител проводили в реакции солевой агглютинации в  96-луночных планшетах для иммунологических реакций, неполных антител — в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса) в пробирках и гелевых картах Liss/Coombs со стандартными эритроцитами фенотипов CCwDee К-, ccDEE К-, ccdee К скрининговой панели и идентификационной панели ( 11-клеточная) фирмы BioRad.

Контроль аутоагглютинации проводили между собственными эритроцитами и сывороткой больной (отрицательный контроль). Определение антигенов M и N проводили при использовании реакции агглютинации на плоскости с моноклональными антителами анти-М и  анти-N фирмы «Гематолог» (Москва). ЭРИТРОТЕСТТМ-Цоликлоны Анти-S, -s, -P1, -Lea, -Leb применяли для выявления соответствующих антигенов с помощью прямой реакции агглютинации в пробирках, а препараты ЭРИТРОТЕСТТМ-Цоликлон Анти-Fya и ЭРИТРОТЕСТТМАнти-Fyb использовали для определения соответствующих антигенов методом непрямой реакции агглютинации в пробирках по методикам производителя («Гематолог», Москва).

Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы BAG (Германия) по методике производителя. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала концентрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяемая по отношению показателей при 260 нм и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6–1,8, а концентрация конечной ДНК — 50–100 нг/мкл.


Для выявления мутаций применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании праймера для выявления генотипов системы АВО ( ABO-TYPE) и Резус ( RH-TYPE) производства фирмы «BAG» (Германия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1 мкг/мл) в TBE буфере при напряженности электрического поля 10–15 В/см. В лунки геля вносили по 10 мкл амплификационной смеси.

Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете (λ = 310 нм) при помощи трансиллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос амплификации внутреннего положительного контроля свидетельствовало о корректности проведенной ПЦР.

Согласно проведенным исследованиям, группа крови больной системы АВО была идентифицирована как Оαβ D- (фотография 1). Молекулярные методы подтвердили наличие генотипа O1O1. Проведенное определение фенотипа эритроцитов с помощью моноклональных антител специфичностей анти-D, -C, -Cw, -c, -E, -e на плоскости (фотография 2) и в гелевых картах (фотография 3) для выявления резусного фенотипа выявило отсутствие всех антигенов системы Резус (фенотип -/- или Rhnull).

Молекулярным методом выявлен генотип CcDee, что указывало на отсутствие повреждения генов локусов RHD и RHCE (фотография 4). Все вместе взятое позволило высказать предположение о наличии регуляторного типа фенотипа Rhnull.

Фенотип Rhnull системы Резус

Результаты исследования эритроцитов больной Ав-н в гелевых картах DiaClon ABO/D Reverse Grouping (фирма BioRad, США)

Пример исследования

Результаты фенотипирования эритроцитов больной Ав-н по системам Резус, MN, Kell с помощью цоликлонов фирмы «Гематолог» (Москва)

Результаты исследовния эритроцитов

Результаты фенотипирования эритроцитов больной Ав-н в гелевых картах DiaClon Rh-Subgroups (фирма BioRad, США) 

Элекртофореграмма продуктов

Результат генотипирования больной Ав-н. Электрофореграмма продуктов амплификации ПЦР при использовании праймеров RH-TYPE производства фирмы BAG (Германия) — CcDee

На эритроцитах присутствовали антигены систем Kell, Duffy, Lewis, Р, Kidd, MNS: фенотип был определен как K−k, Fy(а b−), Le(a−b), P1, Jk(a b−), M−N S−s.

Антиэритроцитарные антитела IgM класса в сыворотке крови больной отсутствовали. При постановке непрямой пробы Кумбса в гелевых картах сыворотка крови агглютинировала все образцы стандартных эритроцитов (реакцию оценивали на 3) скрининговой и идентификационной панелей (фотография 5), но не реагировала с собственными эритроцитами.

Непрямая проба Кумбса в классической постановке с теми же эритроцитами была отрицательной. Полученные результаты мы трактовали как присутствие антирезусных антител IgG класса низкой авидности.

Идентификационная панель

Результаты исследования неполных антител в сыворотке больной Ав-н со стандартными эритроцитами идентификационной панели фирмы BioRad

Известно, что трансфузии эритроцитсодержащих сред больным с фенотипом Rhnull представляют большие проблемы. Из-за отсутствия всех антигенов системы Резус такие больные будут подвержены риску аллоиммунизации при попадании в их организм полноценных аллогенных эритроцитов.

Единственным возможным подходом к заместительной терапии является заготовка и переливания собственных эритроцитов (аутогемотрансфузии).

Статья из журнала "Справочник заведующего КДЛ" № 11, 2015

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.