Пиросеквенирование: опыт использования в системах генетического анализа

159

Пиросеквенирование – одна из методик определения полиморфизмов в геноме человека, позволяющая определить риски развития мультифакторных заболеваний, а также оказывающая помощь практикующим врачам-клиницистам в диагностике того или иного заболевания и в выборе терапевтической тактики.

Пиросеквенирование – одна из методик определения полиморфизмовКроме того, данная технология является очень эффективным инструментом как для количественного определения уже имеющихся соматических мутаций, так и для поиска мутаций в генах, ассоциированных с развитием злокачественных опухолей   

Принципы использования пиросеквенирования

Заболевания сердца, сосудов, легких, желез внутренней секреции и других систем и органов зачастую являются мультифакторными, то есть спровоцированными рядом неблагоприятных условий, часть из которых связана с полиморфизмом нескольких генов ДНК, а часть поддается внешнему влиянию.

На сегодняшний день проведено большое количество научных исследований, подтверждающих влияние полиморфизмов на развитие различных заболеваний мультифакторного характера.

Накопленный опыт позволяет выявлять пациентов, относящихся к группе риска по той или иной патологии, до появления первых клинических проявлений, предсказать риск развития осложнений, выбрать тактику лечения, в том числе медикаментозного.

В связи с этим разработка методик и реагентов для определения клинических важных генетических полиморфизмов – актуальная задача профилактической медицины.

Пиросеквенирование: методика определения генетических полиморфизмов

В современной лабораторной практике известно много различных молекулярно-биологических методик определения полиморфизмов в человеческом геноме. В зависимости от способа определения результата они делятся на прямые и непрямые.

Первая группа методов направлена на определение последовательности нуклеотидов рассматриваемых генетических локусов.

Сравнительная оценка методов определения тестостерона

Сравнительная оценка методов определения тестостерона
посмотреть/скачать>>

К ней относятся:

  • секвенирование по методу Сенгера (метод обрыва цепи);
  • массовое параллельное секвенирование;
  • пиросеквенирование, и др.

К непрямым методам относятся:

  •  Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция
  •  Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
  •  Определение аллелей полиморфных локусов в режиме реального времени
  •  ДНК-гибридизация
  •  Мини-секвенирование с последующим масс-спектрометрическим анализом, и др

Вторая группа методов не нацелена на получение последовательности нуклеотидов в рассматриваемых фрагментах человеческой ДНК, поэтому  наиболее удобными, по мнению многих специалистов, являются прямые методики, среди которых особое место занимает метод пиросеквенирования, или пиросеквенирующего синтеза.

Он неоднократно описан и представлен визуально. Остановимся на нем немного подробнее.

Данная методика предполагает осуществление одновременного синтеза всех специфических молекул ДНК, которые присутствуют в реакционной смеси, а количество пирофосфата, выделившегося в ходе реакции, прямо пропорционально количеству нуклеотидов, встраивающихся при получении новых дочерних молекул ДНК, что позволяет дифференцировать все возможные генотипы рассматриваемого генетического локуса с точки зрения количества.

Эта возможно благодаря современному программному обеспечению систем генетического анализа.

Читайте также в журнале «Справочник заведующего КДЛ»

Возможности метода пиросеквенирования

Возможности метода пиросеквенированияСуть данной методики заключается в том, что с рассматриваемой одноцепочной ДНК заново синтезируется комплиментарная цепочка. В момент присоединения каждого из нуклеотидов регистрируется световая вспышкаю Матрица в это время обездвижена, а растворы нуклеодитов добавляются последовательно и элиминируются после реакции.

Свет возникает тогда, когда раствор нуклеотида соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, дающих световой сигнал, дает возможность определить последовательность матрицы.    

Метод пиросеквенирования позволяет реализовать два типа генетических исследований:

  • определение передающегося по наследству генетического полиморфизма в коротких фрагментах ДНК;
  • анализ смесей ДНК, обнаруживаемых а одном рассматриваемом образце.

На основе возможностей пиросеквенирования разработаны методики, позаоляющие проводить ряд исследований:

  • идентификация однонуклеотидных полиморфизмов с одновременным определением генотитипов двух рядом расположенных однонуклеотидных полиморфизмов;
  • детекция инсерций/делеций нескольких нуклеотидов;
  • определение количества повторов.

Принцип метода пиросеквенирования был использован в ходе анализа смесей ДНК в следующих лабораторных исследованиях:

  • определение соматических мутаций и их количественная оценка;
  • определение частот аллелей в группах пациентов на основе исследования пулированных образцов ДНК.

Другие возможности данной методики, а также опубликованные протоколы лабораторных исследований на его основе приведены в руководстве «Pyrosequencing: Methods And Protocols». В частности, идентификация последовательностей нуклеотидов при помощи метода пиросеквенирования могут быть использованы в целях определения и генотипирования различных микроорганизмов.

Практическое использование тестов на основе пиросеквенирования

На основе технологии пиросеквенирования сегодня разработаны тесты для определения более 200 генетических полиморфизмов.

Часть из них сгруппирована в профили генетических исследований для определения предрасположенности к некоторым мультифакторным патологиям, наследственным формам онкологических заболеваний и другим состояниям.

Значительная часть таких тестов связана с фармакогенетическими исследованиями, направленными, в частности, на определения генетических полиморфизмов, кодирующих ферменты I и II фаз биотрансформации и также транспортеры лекарственных средств.

Практическое использование тестов на основе пиросеквенированияМетод пиросеквенирования дает возможность стандартизации проведения анализов для различных однонуклеотидных полиморфизмов по одному протоколу.

Профили генетических исследований для тех или иных мультифакторных заболеваний могут быть дополнены несколькими однонуклеотидными полиморфизмами, а также возможна оценка сочетаний полиморфизмов из разных профилей , которые исследователь выбирает исходя из поставленных перед ним задач.

Фармакогенетические исследования сегодня являются наиболее актуальной технологией персонализированной медицины, поэтому существует определенная возможность применения сочетаний различных тестов, которые были бы актуальны при выборе адекватной медикаментозной терапии.

Некоторые из профилей исследований уже применяются на практике. Наиболее актуальны из них те, которые объединяют генетические полиморфизмы, кодирующие факторы свертываемости крови, или генетические локусы, связанные с частым возникновением мультифакторных патологий.

Исследования полиморфизмов проводятся:

  • в генах, кодирующих плазменные и агрегационные факторы системы свертываемости крови (риск развития венозных тромбозов и связанных с этим состоянием осложнений, вероятность акушерской патологии;
  • в генах, связанных с метаболизмом фолиевой кислоты (гипергомоцистеинемия – состояние, связанное с нарушением свертываемости крови или в патологическим протеканием беременности у женщин);
  • в генах KCNJ11, PPARG, TCF7L2, и TCF7L2 (риск развития сахарного диабета 2 типа);
  • в генах ADRB2, AGT, AGTR1 и NOS3 (риск развития артериальной гипертензии);
  • в генах BRCA1 и BRCA2 (риск возникновения наследственных форм злокачественных опухолей молочной железы и яичников; не так давно появились сведения о роли мутаций в данных генах в развитии онкологических заболеваний других органов – представтельной железы у мужчин, желудка, поджелудочной железы).
  • в генах VKORC1, CYP4F2, GGCX, CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*5 и CYP2C9*6 (для определения терапевтической дозы варфарина).   

Перспективы методики

Данная технология является наиболее точной в плане работу с индивидуальными образцами, однако сегодня возможности ее использования несколько ограничены.

Это в первую очередь связано с длиной последовательностей нуклеотидов – она составляет порядка 300-500 нуклеотидов. Это может затруднять секвенирование геномов, богатых повторяющимися последовательностями нуклеотидов.  

Метод пиросеквенирования – это удобный инструмент валидации непрямых методов определения однонуклеотидных полиморфизмов, в частности, методик, разрабатываемых в рамках исследований по выявления генетической предрасположенности к ишемическому инсульту или наследственному гемохроматозу.

Технология пиросеквенированияТехнология пиросеквенирования является очень эффективным инструментом как для количественного определения уже имеющихся соматических мутаций, так и для поиска мутаций в генах, ассоциированных с развитием злокачественных опухолей. Это позволяют возможности, связанные с количественным анализом смесей фрагментов ДНК на протяжении нескольких десятков пар оснований.

Усовершенствование систем генетического анализа в последние годы заключается в создании оборудования с целиком автоматизированной процедурой пробоподготовки.

Кроме этого, разработка систем генетического анализа, оборудованных дополнительными картриджами для реакционных смесей дает возможность проведения одновременного определения нескольких последовательностей нуклеотидов в одном образце материала.

Другое направление совершенствования систем генетического анализа связано с с обновлением программного обеспечения и изменением реагентов для репликации ДНК. Это обновления и дополнительные возможности программного обеспечения дают возможность увеличения качества и длины сиквенсов, что также очень важно при оценке неизвестных и гипервариабельных локусов ДНК.

Все оборудование для проведения пиросиквенирования – это открытая система, которая позволяет расширять спектр анализируемых генетических тестов и профилей генетических исследований.

Создание новых тестов для определения генетичсеких полиморфизмов продиктована сведениями о роли генетических факторов в развитии определенных патологий и состояний, информация о которых может применяться для проведения своевременной диагностики и профилактики заболеваний в повседневной практике врачей-клиницистов.      

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»

    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...



      Мероприятия


      Интервью

      ФФОМС Наталья Стадченко

      Председатель ФФОМС Наталья Стадченко в интервью журналу «Здравоохранение»:

      Для медработника страховой представитель – это и контролер, и юридический консультант, и помощник одновременно





      Наши продукты




















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл № ФС77-38302 от 30.11.2009

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль