Внебольничная пневмония: современные методы лабдиагностики

368

Внебольничная пневмония: современные методы лабдиагностики

Внебольничная пневмония – это заболевание, которое возникает вне больничного стационара или по истечении 28 дней после выписки из него, а также инфекционный процесс, развившийся в первые двое суток с момента помещения больного в стационар.

Также этот диагноз ставится гражданам, состоящим на учете в домах и отделениях сестринского ухода, но отсутствующих там 14 дней и более. 

Наиболее простыми, но, тем не менее, точными методами являются микроскопическое и бактериологическое исследование.

К более сложным и специфичным методам относится ПЦР-диагностика, основанная на обнаружении участков генома возбудителя пневмококковой инфекции.

Кроме того, сейчас определённую популярность приобретают так называемые экспресс-тесты, позволяющие быстро обнаружить маркеры пневмококковой инфекции в моче больного.

Диагностика внебольничной пневмонии: цели и этапы

Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии проводятся с целью:

  1. Быстрой постановки точного диагноза.
  2. Выделения чистой культуры S. Pneumoniae.
  3. Определения ее принадлежности к тому или иному серотипу.
  4. Определения ее чувствительности к антибиотикам.

Специфическая лабораторная диагностика складывается из следующих этапов;

  • изучение клинического материала под микроскопом;
  • выполнение бактериологических посевов с последующим морфологическим, иммунологическим и биохимическим определением возбудителя;
  • определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам;
  • определение специфических генетических фрагментов пневмококка или его антигена.

Виды исследований

Микроскопические исследование

Изучение биоматериала под микроскопом – это один из наиболее простых и быстрых способов выявления S. pneumoniae. Бактериоскопия мазка, окрашенного по Грамму, позволяет определить морфотип потенциального возбудителя.

Усовершенствованным вариантом микроскопического исследования является метод Нейфельда,  основанный на феномене набухания капсулы при взаимодействии с неразведенной специфической антисывороткой в присутствии синьки Леффлера.

Приказ о качестве проведения лабораторных исследований

Приказ о качестве проведения лабораторных исследований
посмотреть/скачать>>

Иными словами, капсула пневмококка увеличивается в объеме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируется при помощи светооптической микроскопии.

Капсулы возбудителя резко увеличиваются, если результат исследования положительный, в то время как при отрицательном результате они практически незаметны.

Стоит сказать о том, что реакция набухания специфична – в случае с капсульными микроорганизмами других видов она не дает положительного результата. Но у нее есть один существенный недостаток – она не в состоянии обнаружить S. Pneumoniae, не имеющие капсулы.

Метод Бурри-Гинса также позволяет увидеть пневмококки, не имеющие капсулы. Для этого материал смешивается с тушью, на фоне которой выделяются неокрашенные бактерии и капсулы.

В модификации Гинса данный препарат дополнительно подкрашивается фуксином Циля. Возбудители при этом становятся ярко-малиновыми, в то время как их капсулы окрашиванию не поддаются.    

Отметим, что у больных, проходящих терапию антибиотиками, данные методы могут давать ложноотрицательные результаты. Это объяснятся тем, что при лечении антибактериальными препаратами в биологическом материале могут находится бактерии, лишенные капсулы.

Также следует помнить, что при трансформации S. pneumoniae из S в R-форму капсульные антигены теряются.

Описанные методы достаточно сложны в исполнении и обладают недостаточным уровнем специфичности и чувствительности. Поэтому не нашли частого применения в повседневной лабораторной практике. Кроме того, необходимые для проведения исследования сывороточные антигены обладают имеют высокую цену.

Бактериологическое исследование

Данный вид исследования широко применяется в лабораторной практике, так как позволяет, во-первых, выделить чистого возбудителя, во-вторых – определить его вид произвести серотипирование, и, в-третьих -  определить его чувствительность к антибиотикам. 

Основные сложности методики:

  • особые требования к условиям выращивания культуры;
  • склонность возбудителей к быстрому аутолизу.

Кроме того, достаточно сложно получить мокроту на исследование, которое, к тому же, является довольно продолжительным - результат оценивается по прошествии 2-3 суток с момента забора биоматериала.

Кроме того, при исследовании крови и широком применении антибиотиков диагностическая ценность метода существенно снижается из-за низкого уровня высеваемости.

Определение пневмококков на кровяном агаре начинается с гемолитической реакции стрептококков. S. pneumoniae —это α-гемолитический стрептококк, с трудом отличимый по своим морфологическим признакам роста от других α-гемолитических стрептококков:

  • S. mitis;
  • S. oralis;
  • S. sanguis;
  • S. parasanguis;
  • S. gordonii.

Оптохин (этилгидрокупреина гидрохлорида) способен селективно подавлять рост пневмококка, а соли желчи – провоцировать избирательный лизис колонии S. pneumoniae на агаре или в бульоне. Методика основана на активации пневмококковых аутолизинов — ферментов, которые принимают участие в синтезе клеточной стенки. Это, в свою очередь, приводит к визуальному лизису микроорганизма в течение 30 минут – 2 часов.

Приблизительно 14% пневмококков подвергаются неполному лизису. Дифференциальная диагностика пневмококка проводится с прочими представителями этого рода.

От представителей других родов (Neisseria spp., Haemophilus spp. и Corynebacterium spp.), дающих схожий рост на средах первичного посева с атипичными формами пневмококков, их отличают морфологические особенности, а также оксидазная и каталазная активность.

Определение чувствительности к антимикробным препаратам

Определение чувствительности возбудителя внебольничной пневмонии к антибиотикам – это заключительный этап бактериологического исследования.

  Сегодня теоретически обоснованным считается подход к оценке чувствительности, основанный на признании факта существования различий между микробиологической и клинической чувствительностью/устойчивостью микроорганизмов.

В отечественных клинических рекомендациях «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» описана методология оценки чувствительности бактерий и дрожжей к антибиотикам, даны пограничные значения МПК и зон подавления роста для определения клинических категорий чувствительности, а также приведены экспертные правила оценки чувствительности по системе, принятий в Европейском сообществе.

Для того, чтобы как можно быстрее обнаружить антиген пневмококка, используется методика латекс-агглютинации, основанная на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных антигенов с применением поливалентной специфической пневмококковой сыворотки.

Антиген, содержащийся в рассматриваемом образце, вступает во взаимодействие со специфичными гомологичными антителами, которыми покрыты латексные частицы. Они, в свою очередь, агглютинируют в присутствии гомологичного антигена. Если антигены нет, латексные частицы остаются в форме гомогенной суспензии.

Исследованию подвергаются колонии бактериальной культуры, выросшей на чашке первичного посева, но допустимо использовать и биологический материал – например сыворотку крови или ликвор.

Преимуществами методики являются сравнительная простота и скорость получения результата, к недостаткам относятся дороговизна и невозможность определить антиген в загрязненном биологическом материале.

Полимеразная цепная реакция

Метод ПЦР применяют для определения специфичных участков генома возбудителя пневмонии и других инфекционных агентов. Однако многие виды пневмококка являются нормальными обитателями дыхательных путей человека, и это затрудняет диагностику пневмококковой пневмонии.

Основным преимуществом ПЦР-диагностики является ее сравнительно небольшая стоимость и возбожность определить свойства инфекционного агента без культивирования на питательных средах. Диагностической мишенью при ПЦР-исследовании выступают гены, которые кодируют факторы патогенности S. pneumoniae:

  • пневмолизин (ply);
  • аутолизин (lytA);
  • ген, кодирующий пневмококковый поверхностный антиген (psaA);
  • протеин, участвующий в биосинтезе полисахаридов капсулы (cpsA).

Все эти мишени могут быть использованы для обнаружения ДНК S. pneumoniae в крови, плевральной жидкости и ликворе, поскольку из множества видов стрептококков только она может провоцировать инвазивную инфекцию.

Анализ отделяемого слизистой оболочки ВДП показал, что ply с большой долей вероятности присутствует в геноме S. oralis и S. mitis, а lytA — в геноме S. mitis. Ген, который кодирует пневмококковый поверхностный антиген (psaA), также имеет высокую гомологию со стрептококками группы viridans.

В связи с этим тесты по выявлению данных факторов патогенности допустимо использовать только для крови, ликвора и жидкости из плевральной полости, так как эти локусы являются стерильными.

Исследование материла из нестерильных локусов затруднено, выходом в этом случае может послужить использование ПЦР-анализа в количественном формате.

Помимо этого, ПЦР используется для идентификации серологических типов микроорганизмов, распространенных на конкретных территориях – это позволяет планировать вакцинацию и отслеживать эффективность применяемых вакцин.

В последующем были разработаны схемы идентификации серологических типов S. pneumoniae с использованием ПЦР-исследования в режиме он-лайн. Интернет-ресурс PCR Deduction of Pneumococcal Serotypes содержит схемы ПЦР-исследований, рекомендованные CDC к применению в зарубежных странах.

Они включают в себя постановку 7 реакций ПЦР в режиме реального времени, где каждая реакционная смесь содержит по три серотип-специфические мишени.

В России была разработана альтернативная методика ПЦР в режиме он-лайн, с помощью которой можно определить серотипы пневмококка, ассоциированные с инвазивными формами инфекций.

Она включает серотипы из состава 10- и 13-валентных конъюгированных вакцин. Методика позволяет провести серотипирование до 75% S. pneumoniae, выделенных из ликвора.

ПЦР в режиме он-лайн дополнительно характеризуется меньшим количеством этапов анализа и идентичной чувствительностью применительно ко всем серотип-специфическим мишеням, включенным в реакционную смесь, поскольку в данном случае не нужно выполнять амплификацию мишеней различной длины.

Результаты ПЦР-исследования допустимо рассматривать исключительно в комплексе с результатами иных методик лабораторной диагностики внебольничной пневмонии, вызванной пневмококками.

ИХГ-тест

Сегодня приобретает все большую популярность так называемые быстрые тесты «у постели пациента».

К таковым относится, например, иммунохроматографический экспресс-тест для обнаружения пневмококкового клеточного полисахарида (с-полисахарида) в моче. Однако данный тест может использоваться только у взрослых больных и только перед началом приема антибиотиков.

Данное исследование не рекомендуется проводить у лиц, ранее перенесших внебольничную пневмонию или вакцинированных от нее в течение 5 последних дней. Время тестирования – 15 минут.

Чувствительность и специфичность метода достаточно высоки, однако, несмотря на это, он считается вспомогательным и рекомендуется к использованию у лиц с тяжелым протеканием заболевания.

Кроме того, диагностическая ценность теста значительно ниже в популяциях, характеризующихся высоким уровнем носительства S. pneumoniae. Отрицательный результат данного исследования не гарантирует отсутствия пневмококковой инфекции.

Читайте в ближайших номерах журнала «Справочник заведующего КДЛ»
    Читать >>


    Ваша персональная подборка

      Подписка на статьи

      Чтобы не пропустить ни одной важной или интересной статьи, подпишитесь на рассылку. Это бесплатно.

      Рекомендации по теме

      Мероприятия

      Мероприятия

      Повышаем квалификацию

      Посмотреть

      Самое выгодное предложение

      Самое выгодное предложение

      Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

      Живое общение с редакцией

      А еще...


      Мероприятия








      Наши продукты






















      © МЦФЭР, 2006 – 2017. Все права защищены.

      Портал zdrav.ru - медицинский портал для медицинских работников. Новости и статьи для главных врачей, медицинских сестер, заместителей главного врача, специалистов по качеству медицинской помощи, заведующих КДЛ, медицинских юристов, экономистов ЛПУ, провизоров и руководителей аптек.

      Информация на данном сайте предназначена только для медицинских работников. Ознакомьтесь с соглашением об использовании.
      Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-64203 от 31.12.2015.

      Политика обработки персональных данных

      
      • Мы в соцсетях
      Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам.Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — журнал в формате pdf

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы продолжить чтение статей на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×
      Сайт предназначен для медицинских работников!

      Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, пожалуйста, зарегистрируйтесь.
      Это займет всего 57 секунд. Для вас будут доступны:

      — 9400 статей
      — 4000 ответов на вопросы
      — 80 видеосеминаров
      — множество форм и образцов документов
      — бесплатная правовая база
      — полезные калькуляторы

      Вы также получите подарок — pdf- журнал «Здравоохранение»

      У меня есть пароль
      напомнить
      Пароль отправлен на почту
      Ввести
      Я тут впервые
      И получить доступ на сайт Займет минуту!
      Введите эл. почту или логин
      Неверный логин или пароль
      Неверный пароль
      Введите пароль
      ×