text
Портал для медицинских работников

Преаналистический этап исследования гомоцистеина

  • 30 апреля 2018
  • 53

Клинические исследованияБольшое количество научно-практических исследований и публикаций последних 20 лет были посвящены гомоцистеину как независимому фактору риска раннего развития и быстрого прогрессирования атеросклероза, тромбоза коронарных, церебральных и периферических артерий и вен, а также нейродегенеративных заболеваний и патологии беременности.

Критическим в отношении выявления патологии и проведения терапии является вопрос, с какой точностью может быть измерен уровень гомоцистеина в лаборатории и какой процент изменения его концентрации у конкретного пациента можно достоверно считать динамикой.

Исследование уровня гомоцистеина в крови

В настоящее время отсутствуют согласованные, достаточные по количеству и валидные с точки зрения метода и условий их получения данные, крайне необходимые для успешной стандартизации и обеспечения стабильной клинической точности лабораторного исследования, — об индивидуальной и биологической вариации, а также стабильности гомоцистеина.

Контроль качества клинических лабораторных исследований

Контроль качества клинических лабораторных исследований
посмотреть/скачать>>


В данном исследовании было оценено влияние на сопоставимость результатов исследования уровня гомоцистеина таких компонентов преаналитического этапа, как выбор пробирки для взятия крови и способ ее хранения до и после отделения клеточной фракции.


Исследование уровня гомоцистеина в крови выполняли в лаборатории ФГБУ ВЦЭРМ им А. М. Никифорова. Материалом служили образцы сыворотки и цитратной плазмы крови 32 человек среднего возраста (9 женщин, 23 мужчины), из них 13 — пациенты неврологического отделения, 6 — отделения сердечно-сосудистой хирургии (ССХ) и 13 доноров. Критерии исключения — выраженный при визуальной оценке гемолиз и (или) липемия.

Взятие крови для исследования проводили с 8:30 до 9:30 утра натощак. У исследуемых в соответствии со следующими протоколами ведения преаналитического этапа:

  1. Взятие крови проводили в охлажденные вакуумные пробирки для получения сыворотки, с разделительным гелем. Сыворотку отделяли в течение 30 мин после взятия крови с использованием центрифуги Termo Electron MR23i при 2900 об/мин, 10 мин, t 4 °С.
  2. Взятие крови проводили в пробирки вакуумные для определения гомоцистеина. Плазму отделяли в течение 30 мин после взятия крови с использованием центрифуги Roxita 50RS Hettich при 2900 об/мин, t 22 °С, 10 мин.
  3. Взятие крови в пробирки вакуумные для определения гомоцистеина. Плазму отделяли через 6 ч после взятия крови (хранение при комнатной температуре).
  4. Взятие крови в пробирки вакуумные для определения гомоцистеина. Плазму отделяли через 72 ч после взятия крови (хранение в условиях холодильника).

Исследование уровня гомоцистеина в крови выполняли методом твердофазного конкурентного хемилюминесцентного иммуноферментного анализа на автоматическом анализаторе закрытого типа «Иммулайт XPi» с использованием набора реагентов «Гомоцистеин». Экспериментальная часть исследования была проведена в течение 9 дней.

Инструкция по применению реагентовСтатистический анализ результатов проводили с использованием Statistica 6.0. Для определения достоверности различий использовали t-критерий Вилкоксона, U-критерий Манна — Уитни, регрессионный анализ.

Для построения графиков линейной регрессии использовали материалы сайта westgard.com/validation-tools-2.htm. Данные в тексте и в таблицах представлены в виде Ме — медиана, 25 и 75 — 1-й и 3-й квартили и М ± SD (М — среднее арифметическое, SD — среднеквадратичное отклонение).

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Согласно инструкции для данного набора реагентов ориентировочный 95%-ный референтный интервал составляет 5–12 мкмоль/л, Ме — 7,7 мкмоль/л (по результатам исследования плазмы крови 120 здоровых доноров).

Для проведения внутрилабораторного контроля качества использовали независимый трехуровневый контрольный материал «Ликвичек „Миокардиальные Маркеры Плюс“» (Bio-Rad, США) с 2013 года (табл. 1, 2).

Контрольный материал предназначен для исследования данного аналита, однако не содержит информации о его аттестованном значении и стабильности. Контрольный материал после размораживания аликвотировали и хранили при температуре -20 ºС до 30 дней в соответствии с рекомендацией производителя.

Результаты контрольных исследований обрабатывали при помощи лабораторной информационной системы qLIS «СПАРМ».

Оценка правильности исследования уровня гомоцистеина значительно затруднена в связи с тем, что данный аналит не представлен в международной программе внешней оценки качества EQAS.

Оценка воспроизводимости и промежуточной прецизионности теста

Воспроизводимость теста по данным производителя и по данным внутрилабораторного контроля качества сопоставима.

Таблица 1

Данные о воспроизводимости определения гомоцистеина с использованием набора реагентов «Гомоцистеин» и анализатора «Иммулайт XPi»

Диапазон концентрации относительно референтного

CV внутрисерийный, %

заявленный производителем системы реагентов, 4 повтора

max фактический внутрилабораторный, 4 повтора

с использованием контрольного материала «Ликвичек „Миокардиальные Маркеры Плюс“», 4 повтора

с использованием сывороток пациентов, 5 повторов

Нижняя граница референтного диапазона

7,4

-

7,4

Верхняя граница референтного диапазона

3,4–4,8

3,7

6,5–9,82

Выше референтного диапазона

4,1

4,9

-

Таблица 2

Данные о промежуточной прецизионности определения гомоцистеина с использованием системы реагентов «Гомоцистеин», «Иммулайт 2000/XPi»

Диапазон концентраций

Среднее значение контрольного материала, мкмоль/л

CV межсерийный, %

заявленный производителем системы реагентов, 20 серий

с использованием контрольного материала «Ликвичек „Миокардиальные Маркеры Плюс“»

фактический внутрилабораторный

данные международной программы межлабораторного сличения UNITY

лот № 29850, 20 серий

лот № 29840, 25 серий

лот № 29850

лот № 29840

Нижняя граница референтного диапазона

7,85

10,4

7,0

6,6

7,9

9,6

Верхняя граница референтного диапазона

11,32

4,1–7,6

6,3

6,7

6,7

7,4

Выше референтного диапазона

31,85

5,1

6,2

6,7

8,4

7,5

Межсерийный коэффициент вариации, полученный с использованием контрольного материала, в диапазоне референтных значений оказался меньше заявленного производителем системы реагентов и верифицирует его.

В диапазоне значений выше референтного межсерийный коэффициент вариации превышает заявленный производителем системы реагентов, однако ниже полученного по данным международной программы межлабораторного сличения. Предельно допустимое значение CV определения гомоцистеина в контрольном материале не регламентировано и отсутствует в соответствующем приложении, А к ГОСТ 53133.2–2008.

Обращает на себя внимание также то, что и в других регламентирующих качество работы лаборатории документах отсутствует информация, позволяющая однозначно оценить аналитические характеристики данного теста с клинической точки зрения.

Так, в Приложении Б к Национальному стандарту РФ ГОСТ Р 53022.2–2008 данные о биологической вариации гомоцистеина указаны лишь для определения его концентрации в плазме (CVi — 2,8% (не согласуется с литературными данными), CVg — 6,4%) и, соответственно, в качестве целевого указан СV — 2,1%, что по меньшей мере в два раза ниже заявленного производителем.

При этом на сайте westgard.com значения аналогичных показателей составляют: CVi — 8,3% (согласуется с литературными данными), CVg — 33,5%, целевой коэффициент промежуточной прецизионности — 4,15%, что также ниже заявленного производителем и полученного нами с использованием контрольного материала.

Кроме того, в литературе присутствуют и следующие целевые характеристики для определения концентрации гомоцистеина в плазме: CVi — 9%, CVg — 40,3%, предельно допустимое значение коэффициента промежуточной прецизионности — 4,5%.


Таким образом, фактический коэффициент промежуточной прецизионности, полученный нами при определении концентрации гомоцистеина в плазме, не соответствует целевому, однако:

  • соответствует как заявленному производителем, так и полученному по данным международной программы межлабораторного сличения;
  • не имеет согласованных/единых регламентированных пределов для определения в контрольном материале;
  • является долгосрочно стабильным — доказано: коэффициент вариации стабильный на протяжении 4 лет (с 2013 г.).

Выявленное несоответствие фактического коэффициента промежуточной прецизионности целевому, на наш взгляд, — отражение глобальной для лабораторной диагностики проблемы.

В настоящее время отсутствуют согласованные данные об индивидуальной и биологической вариации, а также стабильности многих аналитов, достаточные по количеству и валидные с точки зрения метода и условий их получения, которые крайне необходимы для успешной стандартизации лабораторных процессов и формирования критериев их качества.

Данный факт не лишает методику ее несомненных достоинств, в том числе по простоте выполнения, и не имеет достоверной оценки относительно его клинической значимости в связи с недостаточностью и несогласованностью теоретических и практических данных.

Таким образом, показатели воспроизводимости и промежуточной прецизионности определения гомоцистеина в лаборатории оцениваются как удовлетворительные, стабильные и согласованные с результатами межлабораторного сличения.

На верхней границе принятия клинического решения (12–15 мкмоль/л) вариабельность теста составляет 6,3%, что (без учета смещения, которое в данном исследовании не оценивалось) может быть выражено в виде расширенной неопределенности результата: 15,0 /- 1,9 мкмоль/л.

Результаты исследования уровня гомоцистеина в группах образцов, подготовленных по протоколам № 1–4, представлены в табл. 3.

Данные исследования в плазме приведены с учетом указанного в инструкции коэффициента разведения цитратом 1,1. В таблицу также внесены дополнительные сведения: результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови, полученной по протоколу № 1, после трехдневного хранения в условиях холодильника, а также их качественная оценка относительно референтного диапазона.

Таблица 3

Результаты исследования уровня гомоцистеина (референтный диапазон: 5–12 мкмоль/л) в группах образцов, полученных с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа

Протокол

№ 1 Сыворотка,

30 мин

Сыворотка, 72 ч

№ 2 Цитратная плазма, 30 мин

№ 3 Цитратная плазма, 6 ч

№ 4 Цитратная плазма, 72 ч

n

32

27

32

32

32

Min

6,57

5,57

5,47

5,81

5,33

1-й кв.

9,09

8,94

7,7

7,84

7,43

Ме

10,5

10,8

8,88

9,2

8,18

3-й кв.

14,28

14,25

11,31

11,83

10,13

Мах

39,9

41,9

35,85

34,63

37,2

M

12,87

12,27

10,7

10,79

10,3

SD

7,22

7,05

6,03

5,75

6,32

Количество результатов выше референтного диапазона, n

10

Соответствует № 1

6

7

6

При субъективной оценке сопоставимость всех результатов признали удовлетворительной. Однако нами отмечено, что количество результатов, превышающих референтный диапазон, в группе значений, полученных при исследовании сыворотки, было выше и составило 10 случаев относительно 6–7 случаев при исследовании плазмы.

При этом отсутствовали случаи высокого уровня гомоцистеина, выявленные только при исследовании плазмы и не выявленные при исследовании сыворотки.

Ситуации, когда в сыворотке было выявлено превышение референтного диапазона, а в плазме уровень гомоцистеина определялся в пределах референтного диапазона, распределились по протоколам № 2–4 в случайном порядке.

Повышенные уровни гомоцистеина при исследовании в сыворотке были выявлены у 7 из 13 (54%) пациентов, находящихся на стационарном лечении в неврологическом отделении, и у 2 из 6 (33%) пациентов отделения сердечно-сосудистой хирургии. В группе доноров уровни гомоцистеина находились в пределах референтного диапазона.

На следующем этапе мы провели расчет и оценку коэффициентов вариации (табл. 4), а также сравнение результатов определения концентрации гомоцистеина (табл. 5) в образцах, полученных в соответствии с протоколами ведения преаналитического этапа.

Таблица 4

Коэффициент вариации результатов одновременного (в дублях) определения концентрации гомоцистеина в образцах, полученных с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа

Протоколы сравнения

CV% результатов определения в дублях

min

средний

max

Сыворотка 30 минут (протокол № 1) Повторное исследование протокола № 1 через 72 ч

0,2

3,11

7,34

Плазма 30 мин (протокол № 2) Плазма 6 ч (протокол № 3)

0,27

3,6

9,3

Плазма 30 мин (протокол № 2) Плазма 72 ч (протокол № 4)

0,22

5,6

13,56

Сыворотка 30 мин (протокол № 1) Плазма 30 мин (протокол № 2)

0,49

9,2

21,29

Сравнение данных позволяет отметить следующее:

1. Не выявлено различий между результатами определения концентрации гомоцистеина в образцах плазмы, полученных по протоколам № 2 (центрифугирование в течение 30 мин после взятия крови) и № 3 (центрифугирование через 6 ч хранения крови при комнатной температуре).

Данный факт указывает на возможность хранения образцов крови, полученных с использованием пробирок для определения гомоцистеина, 6 ч до момента центрифугирования, что может способствовать решению рассмотренной выше проблемы доставки образцов в централизованную лабораторию, существенно упростить и, главное, стандартизировать исследование уровня гомоцистеина, что, несомненно, приведет к повышению точности его результатов.

2. Не выявлено различий между результатами определения концентрации гомоцистеина в образцах сыворотки крови, полученных по протоколу № 1, и в тех же образцах через 72 ч хранения в условиях холодильника.

Коэффициенты вариации результатов определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови (протокол № 1) и в том же образце через 72 ч хранения в условиях холодильника были наиболее низкими среди полученных в настоящем исследовании: минимальный коэффициент вариации составил 0,2%, максимальный — 7,3% (приближен к межсерийному CV%); средний — 3,11% (< межсерийного CV%) .

Данный факт представляется нам важным, так как позволяет проводить повторные исследования уровня гомоцистеина в случае возникновения сомнений на постаналитическом этапе и обнаружении случайных ошибок, а также выполнять транспортировку образцов сыворотки в условиях холодильника в течение 72 ч после взятия крови.

3. Выявлены отличия результатов определения концентрации гомоцистеина в образцах плазмы, полученных по протоколам № 2 (центрифугирование в течение 30 мин после взятия крови) и № 4 (центрифугирование через 72 ч хранения в условиях холодильника); t-критерий Вилкоксона находился в зоне неопределенности (p < 0,05).

При визуальной оценке образцов плазмы в пробирках1, центрифугирование которых проводилось через 72 ч после взятия крови, спустя некоторое время после выполнения исследования наблюдали гемолиз, который заметно нарастал в течение рабочего дня.

Вероятно, этим обусловлена рекомендация производителя пробирок проводить центрифугирование непосредственно перед исследованием в лаборатории.

При использовании протокола № 4 через сутки после центрифугирования и исследования уровня гомоцистеина гемолиз в пробирках был крайне выраженным, и выполнение дублирующего исследования не представлялось возможным.

Данный факт, на наш взгляд, необходимо учитывать при выборе варианта ведения преаналитического этапа как не позволяющий выполнять повторные исследования в том же образце при возникновении сомнений и обнаружении случайных ошибок.

Возможно, следует изучить и обозначить допустимое время хранения образцов плазмы после центрифугирования и учитывать полученные результаты при планировании очередности выполнения исследований гомоцистеина в лаборатории, особенно при большом их потоке и полной загруженности анализаторов.

4. Выявлены различия между результатами определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови, полученной по протоколу № 1 (центрифугирование в течение 30 мин после взятия крови), и в плазме, полученной по протоколу № 2 (центрифугирование в течение 30 мин после взятия крови); t-критерий Вилкоксона находился в зоне значимости (p < 0,01), U-критерий Манна — Уитни — в зоне неопределенности (р < 0,05).

Выявленные различия между результатами определения концентрации гомоцистеина в сыворотке и плазме оказались значимыми и для клинической трактовки: уровень гомоцистеина при исследовании в плазме был ниже, чем при исследовании в сыворотке, количество результатов выше референтного диапазона — больше в группе образцов, полученных по протоколу № 1.

В связи с этим и учитывая значение Slope 0,8 (табл. 5), считаем возможной корректировку значений определения концентрации гомоцистеина в плазме и ввод дополнительного к инструкции поправочного коэффициента — 1,2, который может быть применен либо для референтных пределов, либо для результатов исследования концентрации гомоцистеина в плазме.

Коэффициент был рассчитан на основании формулы Slope = r x SD1/SD2 и предположения, что, если значение Slope и r равны 1,0, различия между переменными можно считать минимальными.

Таблица 5

Результаты сравнения значений концентрации гомоцистеина при исследовании с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа

Протоколы

n

M SD

Me

Критерии сравнения

t-крите- рий Вилкок- сона, Р <

U-крите- рий Манна — Уитни, p <

Slope уравнения линейной регрессии

r уравнения линейной регрессии

Сыворотка 30 минут (протокол № 1)

32

12,87 ± 7,22

10,5

0,01

0,05

0,8130

0,9737

Плазма 30 мин (протокол № 2)

32

10,70 ± 3,03

8,88

Плазма 30 мин (протокол № 2)

32

10,7 ± 6,03

8,88

-

-

0,9421

0,9883

Плазма 6 ч (протокол № 3)

32

10,79 ± 5,75

9,20

Плазма 30 мин (протокол № 2)

32

10,7 ± 6,03

8,88

0,05

-

1,0288

0,9821

Плазма 72 ч (протокол № 4)

32

10,3 ± 6,32

8,18

Сыворотка 30 минут (протокол № 1)

32

12,87 ± 7,22

10,5

-

-

1,0472

0,9840

Плазма 72 ч (протокол № 4)

27

12,27 ± 7,05

10,8

Введение данного коэффициента может быть подкреплено тем фактом, что отношение средних значений в группах результатов, полученных по протоколам № 1 (12,87) и № 2 (10,7), также равно 1,2.

Величина предложенного коэффициента согласуется с «Клиническим руководством Тица по лабораторным тестам», где указано, что уровень гомоцистеина при определении в цитратной плазме на 10–25% ниже, чем в сыворотке.

Результаты исследования уровня гомоцистеина в группах образцов, полученных с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа, с учетом предложенного нами дополнительного к инструкции поправочного коэффициента 1,2 (для результатов исследования в плазме) представлен в табл. 6.

Данные сравнения уровней гомоцистеина, полученных по протоколу № 1 и скорректированных значениями по протоколу № 2, представлены в табл. 7 и на рисунке.

Таблица 6

Результаты исследования уровня гомоцистеина в группах образцов, полученных с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа, с учетом дополнительного к инструкции поправочного коэффициента 1,2 (для результатов исследования в плазме)

Сыворотка, 30 мин

Плазма, 30 мин

Плазма, 6 ч

Плазма, 72 ч

K дополнительный

нет

1,2

нет

1,2

нет

1,2

Min

6,57

5,47

6,56

5,81

6,97

5,33

6,4

1-й кв.

9,09

7,7

9,24

7,84

9,40

7,43

8,92

Ме

10,5

8,88

10,66

9,2

11,03

8,18

9,81

3-й кв.

14,28

11,31

13,57

11,83

14,19

10,13

12,16

Max

39,9

35,85

43,02

34,63

41,56

37,2

44,64

M

12,87

10,7

12,84

10,79

12,95

10,3

12,36

SD

7,22

6,03

7,23

5,75

6,9

6,32

7,58

Количество результатов выше референтного диапазона, n

10

6

10

7

10

6

8

Как следует из данных таблицы, введение дополнительного к инструкции поправочного коэффициента выравнивает сопоставимость статистических параметров и клинических оценок в группах результатов, полученных с использованием различных вариантов ведения преаналитического этапа.

Поправочный коэфициент

Рис. График линейной регрессии при сравнении результатов определения концентрации гомоцистеина в сыворотке, полученной по протоколу № 1, и в плазме, полученной по протоколу № 2, с использованием дополнительного к инструкции поправочного коэффициента 1,2

Таблица 7

Результаты определения концентрации гомоцистеина в образцах, полученных по протоколам № 1 и 2, с использованием дополнительного к инструкции поправочного коэффициента 1,2

t-критерий Вилкоксона, n = 32

U-критерий Манна — Уитни, n = 32

U эмп.

Критические значения

U эмп.

Критические значения

р ≤ 0,05

р ≤ 0,01

р ≤ 0,05

р ≤ 0,01

246

175

140

489

389

338

t эмп. находится в зоне незначимости

U эмп. находится в зоне незначимости

Введение дополнительного к инструкции поправочного коэффициента изменило значения t-критерия Вилкоксона и U-критерия Манна — Уитни таким образом, что различия между результатами определения концентрации гомоцистеина в сыворотке, полученной по протоколу № 1, и в плазме, полученной по протоколу № 2, стали недостоверными.

Выводы по проведенным исследованиям

Использование специализированных пробирок (со стабилизатором) способствует стандартизации исследования уровня гомоцистеина и позволяет выполнять определение его концентрации в плазме в случае невозможности проведения центрифугирования сразу после взятия крови.

Результаты исследования уровня гомоцистеина в образцах плазмы, центрифугирование которых проводилось через 6 ч после взятия крови, при умножении на предложенный нами дополнительный к инструкции коэффициент 1,2 не отличаются от результатов, полученных при исследовании в сыворотке.

В образцах плазмы, полученной через 72 ч после взятия крови в специализированные пробирки (со стабилизатором), в течение рабочего дня развивался гемолиз, который затруднял выполнение повторных исследований в случае их необходимости.

При использовании образцов сыворотки в течение 72 ч после взятия крови возможна их транспортировка в условиях холодильника и проведение дублирующих исследований.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы подтвердить ваш статус, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Сайт предназначен для медицинских работников!


Чтобы скачать файл на портале ZDRAV.RU, зарегистрируйтесь, и:

Читайте экспертные
материалы

Скачивайте готовые
формы и СОПы

Смотрите
бесплатные вебинары

13 000 статей

1 500 инструкций

200 записей

Абонемент в электронную медицинскую библиотеку в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
×

×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.