text

🎁 Журнал+чайник в ПОДАРОК! УСПЕТЬ ➤➤➤

Здравоохранение

Проточная цитометрия в диагностике и мониторинге множественной миеломы

  • 18 июня 2018
  • 54

Множественная миеломаСтатья посвящена рассмотрению современного состояния диагностики и мониторинга множественной миеломы. Согласно данным, достижение иммунофенотипической ремиссии обладает прогностической ценностью для таких показателей, как продолжительность жизни без прогрессирования заболевания и общей продолжительности жизни, а также является наиболее релевантным прогностическим фактором у больных — кандидатов на аутотрансплантацию стволовых клеток.

За последние 20 лет парадигма лечения множественной миеломы (ММ) претерпела значительные изменения. В течение долгого времени целью лечения являлось достижение частичной ремиссии или стабилизации заболевания.

Однако благодаря внедрению в клиническую практику высокодозной терапии с последующей аутотрансплантацией стволовых клеток (ВДТ/АТСК) появилась возможность достижения полной ремиссии примерно у 35% больных миеломой.

Следует отметить: ни стандартные, ни новые препараты не способны обеспечить полное уничтожение всех клеток миеломы, в результате рецидив развивается вследствие минимальной остаточной болезни (МОБ) у большинства больных.

Диагностика и мониторинг множественной миеломы

Для разработки эффективных стратегий поддержки ремиссии необходимы чувствительные методы оценки эффекта терапии с целью определения оптимальной продолжительности лечения и поддержки больного в состоянии ремиссии в течение как можно более продолжительного времени.

СОЭ – сравнение воспроизводимости различных методов

СОЭ – сравнение воспроизводимости различных методов
посмотреть/скачать>>

Опыт централизации лабораторной службы

Опыт централизации лабораторной службы
посмотреть/скачать>>


В гематологии считается практически общепринятым, что достижение и поддержание высококачественной ремиссии является первостепенным требованием положительного результата лечения.

У больных миеломой полная ремиссия определяется как отсутствие М-протеина по данным иммунофиксации и присутствие менее 5% плазматических клеток в костном мозге.

Большинство исследований показали, что достижение полной ремиссии после лечения ассоциируется с увеличением продолжительности жизни без прогрессирования заболевания, однако в ряде работ указывается, что показатели полной ремиссии не всегда коррелируют с увеличением продолжительности жизни.

Это несоответствие можно объяснить, по крайней мере отчасти, низкой чувствительностью метода морфологического подсчета плазматических клеток и высокой степенью вариабельности клинических проявлений как между больными, так в каждом конкретном случае.



Также высказано предположение, что прогностическое значение достижения полной ремиссии может зависеть от типа лечения, возраста и исходного состояния больного.

В связи с этим можно считать, что данный критерий не обладает достаточной точностью для выявления больных, которым может принести клиническую пользу дополнительная терапия в ранние сроки после лечения .

 Проточная цитометрия в диагностике О централизованных лабораторных информационных системах и их целесообразности подробно расскажем в статье "Справочник заведующего КДЛ">>

Международная рабочая группа по изучению миеломы (IMWG) предложила использовать новую категорию эффекта лечения — «строгая полная ремиссия», для которой требуется нормализация отношения свободных легких цепей в сыворотке крови (sFLC) и отсутствие клональных плазматических клеток по данным иммуногистохимического и флуоресцентного исследований.

Важно отметить, что измерение уровня М-протеина и определение отношения свободных легких цепей в сыворотке периферической крови пациента отражает только количество продукта секретирующего клона, но не обеспечивает прямое количественное определение остаточной опухолевой массы.

В связи с этим длительное время полужизни некоторых иммуноглобулинов, в частности — парапротеинов IgG, может обусловливать появление ложноположительного результата. На данный момент уже подтверждена важность морфологического исследования костного мозга даже у больных с отрицательным статусом М-протеина после терапии.

Однако, в отличие от острых лейкозов, стандартное морфологическое исследование костного мозга при ММ в общем случае не позволяет различать нормальные и злокачественные плазматические клетки, что снижает чувствительность цитологического анализа в период наблюдения.

Иммунофенотипирование методом многопараметрической проточной цитометрии (МПЦ) позволяет исследовать экспрессию и интенсивность флуоресценции большого числа маркеров на большом числе клеток.

Метод позволяет различать аномальные, нормальные и реактивные плазматические клетки, несмотря на низкий уровень этих клеток в костном мозге.

Это уникальное качество присуще только данному методу, поскольку ни стандартные морфологические, ни молекулярные подходы по отдельности или вместе не обладают способностью различать клональные и нормальные плазматические клетки.

Это очень важно, т. к. в дополнение к мониторингу опухолевых плазматических клеток иммунофенотипирование позволяет отслеживать восстановление нормальных плазматических клеток, а это является важной прогностической информацией.

В контексте ММ и других аномалий плазматических клеток показана клиническая значимость МПЦ для дифференциального диагноза моноклональной гаммапатии неясного генеза (МГНГ) и ММ, выявления групп повышенного риска МГНГ, дремлющей ММ (дММ) и ММ.

 Проточная цитометрия в диагностике Читайте также: "Метод проточной цитометрии в диагностике нарушений иммунной системы">>

Иммунофенотипический анализ плазмоцитов

Достижения в разработке аппаратуры и программного обеспечения для проточной цитометрии за последние годы привлекли внимание к использованию результатов иммунофенотипических исследований в лечении гемобластозов.

МПЦ позволяет:

  1. Одновременно анализировать несколько параметров на основе одной клетки.
  2. Изучать большое число клеток в пределах относительно короткого промежутка времени, что позволяет хранить информацию для последующих анализов.
  3. Проводить количественный анализ экспрессии антигенов.
  4. Объединять выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов.

Эти свойства позволяют идентифицировать, определять количество и характеризовать плазматические клетки даже при небольшом количестве клеток благодаря использованию различных маркеров и двухэтапной процедуре получения.

Установлено, что антигены CD38 и CD138 лучше всего подходят для специфической идентификации плазматических клеток в гематологических образцах и их определения на фоне других популяций лейкоцитов.

Несмотря на то что CD38 экспрессируется на большом числе гематопоэтических клеток, этот антиген считают «специфическим» маркером благодаря высокой интенсивности окрашивания на плазматических клетках, которая выделяет эти клетки из других популяций.

В свою очередь окрашивание CD138 также считают специфичным, хотя встречаются плазматические клетки с низким уровнем экспрессии CD138 и даже с полным отсутствием CD138. В связи с этим для эффективной идентификации плазматических клеток предлагается использовать оба маркера.

Для идентификации нормальных и опухолевых плазматических клеток необходимо использовать маркеры плазматических клеток, экспрессия которых различна в норме и при патологии.

Таблица 1

Список информационных антигенов для определения злокачественных плазматических клеток при множественной миеломе

Антиген

Уровень нормальной экспрессии на плазматических клетках костного мозга

Уровень аномальной экспрессии на плазматических клетках костного мозга

CD38

Высокий уровень экспрессии

Уровень экспрессии ниже (в сравнении с нормальными ПК)

CD45

Гетерогенная экспрессия

Отрицательная экспрессия

CD19

Положительная экспрессия

Отрицательная экспрессия

CD56

Отрицательная экспрессия

Высокий уровень экспрессии

CD117

Отрицательная экспрессия

Положительная экспрессия

CD27

Высокий уровень экспрессии

Отрицательная экспрессия

CD81

Положительная экспрессия

Отрицательная экспрессия

CD200

Слабоположительная экспрессия

Высокий уровень экспрессии

Таким образом, необходимо иметь иммунофенотипические панели, содержащие четыре и более маркеров в многоцветных комбинациях, а также панели антител в соответствии с перечисленными маркерами; это позволит выявлять наличие фенотипических аномалий более чем у 90% больных ММ.

Использование 8-цветных панелей позволяет выявлять клональные плазматические клетки у всех больных благодаря одновременной оценке рестрикции легких цепей и аберраций антигенов.

Панель моноклональных антител для выявления МОБ, используемая в нашей лаборатории, составляет две пробирки.


Таблица 2

Панель моноклональных антител для выявления МОБ

Пр-ка

FITC

PE

PerCP-Cy5.5

PE-Cy7

APC

APC-H7

V450

V510

№ 1

CD38

CD56

CD27

CD117

CD138

CD81

CD19

CD45

№ 2

cytIgL

CD200

CD138

cytIgK

CD38

CD19

CD45

Последовательность пробоподготовки образца костного мозга для идентификации МОБ:

  1. Проточная цитометрия в диагностике и мониторинге множественной миеломыОбразец костного мозга дважды отмыть в 10-кратном избытке забуференного физиологического раствора (ЗФР). Это необходимо для правильного окрашивания моноклональными антителами для идентификации свободных цепей иммуноглобулинов.
  2. Образец костного мозга должен быть лизирован, чтобы популяция эритроцитов не мешала дальнейшему анализу. Реагенты для лизиса эритроцитов должны иметь маркировку IVD (InVitroDiagnostic). Выделение клеток на градиенте плотности недопустимо.
  3. Выделение гейта плазматических клеток должно проводиться по трем маркерам: CD45, CD38, CD138, только в этом случае достигается оптимальная чистота выделения популяции плазматических клеток (рис. 1).
  4. Проточная цитометрия в диагностике и мониторинге множественной миеломыОценка экспрессии антигенов: минимальная панель моноклональных антител для идентификации плазматических клеток CD19, CD45, CD38, CD56 и CD138. CD81, CD27, CD117 и CD200 представляют дополнительную информацию для выявления патологических плазматических клеток и по возможности должны быть включены в диагностическую панель антител
  5. Контроль: нормальные клетки, которые присутствуют в костном мозге, обеспечивают положительный и отрицательный контроль. Использование изотипического контроля не требуется.
  6. В гейт плазматических клеток необходимо собрать минимум 100 событий. Для достижения чувствительности метода 0,01% необходимо собрать 1 000 000 клеток из образца.
  7. Необходимо учитывать качество забранного образца костного мозга на наличие гемодилюции. Разведение образца костного мозга периферической кровью может искажать результат.
  8. Цитоплазматическое окрашивание моноклональными антителами легких цепей иммуноглобулинов важно для идентификации моноклональности патологического клона плазматических клеток.

Чувствительность иммунофенотипирования для оценки МОБ при множественной миеломе

Чувствительность иммунофенотипирования напрямую зависит от минимального числа событий, необходимых для определения интересующей исследователя популяции, а оно, в свою очередь, определяется типом фенотипических аберраций, комбинации моноклональных антител, которые используются для детекции, и исследуемого образца.

Известно, что для правильного определения популяции требуется всего 20 событий. Однако в последних опубликованных рекомендациях European Myeloma Network содержится указание на необходимость наличия не менее 100 неопластических плазматических клеток для точного анализа.

В условиях нашей лаборатории в экспериментах с разведением нами показано, что иммунофенотипическая дифференциация нормальных и злокачественных плазматических клеток на основе МПЦ имела чувствительность более 10–4.

Применяя восьмицветную МПЦ, можно достигать уровня чувствительности аллель-специфическая ПЦР и даже превосходить его.

 Проточная цитометрия в диагностике Трактовка результатов иммуногематологических исследований у больных множественной миеломой, подробно в нашей новой статье">>

Потенциальные ограничения иммунофенотипирования в определении МОБ

По опыту применения проточной цитометрии для определения МОБ при других видах гемобластозов постоянно указываются два основных недостатка:

  • отсутствие опухолеспецифических маркеров;
  • появление в процессе развития заболевания фенотипических изменений, которые могут приводить к ложноотрицательным результатам.

Однако в контексте ММ злокачественные плазматические клетки достаточно легко идентифицировать на основе множественных и синхронно определяемых фенотипических аберраций, которые позволяют четко отграничить злокачественные клетки от нормальных.

Таким образом, наиболее важное значение приобретает правильное составление разнообразных комбинаций моноклональных антител, также обязательным требованием является одновременная оценка экспрессии антигенов CD19, CD45 и CD56.

Тем не менее это не исключает появления фенотипических изменений после терапии. На самом деле такие изменения действительно имеют место, но, скорее всего, они связаны с другими типами маркеров, а не с теми, которые были перечислены выше.

Соответственно, фенотипические аберрации, выявленные при постановке диагноза, могут использоваться как (антигенные) зонды, специфичные для конкретного больного, при определении МОБ в период последующего наблюдения.

Другим недостатком является тот факт, что иммунофенотипические исследования для определения МОБ исключительно сфокусированы на популяцию плазматических клеток костного мозга.

Действительно важным ограничением проточной цитометрии при определении МОБ является характерная очаговая структура миеломной инфильтрации костного мозга и (или) возможность экстрамедуллярного рецидива, при котором методы визуализации могут играть очень большую роль в процессе мониторинга МОБ.

Категории ремиссии

Было показано, что достижение иммунофенотипической полной ремиссии коррелирует с более высокой выживаемостью без прогрессирования и более продолжительным временем до прогрессирования заболевания по сравнению с обычной полной ремиссией и строгой полной ремиссией.

Также было показано, что молекулярный метод определения МОБ, метод иммунофиксации и цитометрический метод дают дополняющую друг друга информацию, поэтому необходимо разработать более точные критерии оценки эффекта при ММ.

В совокупности все эти результаты указывают, что достижение иммунофенотипической ремиссии обладает большей клинической значимостью, чем достижение полной ремиссии, поскольку позволяет выделить группы больных с различным исходом.

Одним из недостатков определения полной ремиссии является зависимость этого эффекта от исходных клинических и биологических характеристик больных, тогда как статус МОБ по данным проточной цитометрии позволяет статистически значимо выделять пациентов с более благоприятным прогнозом (МОБ-) и менее благоприятным прогнозом (МОБ) независимо от скорости пролиферации злокачественных плазматических клеток (S-фаза), уровней микроглобулинов β2 и статуса заболевания (ISS).

Важную роль при данном заболевании играют цитогенетические исследования, группа испанских исследователей определяла прогностическое значение статуса МОБ в разных FISH-цитогенетических подгруппах риска.

В подгруппе стандартного риска (отсутствие t (4;14), t (14;16) и del (17р); n = 81) продолжительность жизни без прогрессирования заболевания была больше у МОБ- больных по сравнению с МОБ.

Эти факты в совокупности указывают на необходимость уточнения критерия оценки эффекта терапии ММ, который должен включать с настоящего времени и далее новый — иммунофенотипический — статус.

Прогностический фактор, способный перспективно идентифицировать больных с неустойчивой полной ремиссией, — это наличие цитогенетических показателей высокого риска, выявленных методом FISH, и персистенция МОБ по данным проточной цитометрии на 100-й день после ВДТ/АТСК.

Эти два лабораторных показателя являются единственными независимыми факторами предсказания неустойчивой полной ремиссии. Следовательно, эти два показателя позволяют идентифицировать больных в полной ремиссии с высоким риском раннего прогрессирования после ВДТ/АТСК, в лечении которых можно попробовать использовать новые препараты.

Последующий мониторинг минимальной остаточной болезни при множественной миеломе

В научном сообществе исследователей миеломы крепнет убеждение в том, что основной целью лечения на ближайшее будущее является перевод этого неизлечимого заболевания в хроническое состояние (особенно у лиц из группы низкого риска).

Хорошо известно, что это возможно только в случае достижения высококачественной устойчивой ремиссии. Соответственно, в последнем исследовании группы из Арканзаса показано, что для достижения длительной ремиссии важнее поддерживать полную ремиссию, а не достичь ее как можно раньше.

Поэтому необходимо определить режимы персонализированной поддерживающей терапии на основании индивидуальных уровней остаточного заболевания, а для этого необходимы методы, которые были бы одновременно высокочувствительными и легко осуществимыми.

В этой связи некоторые исследования последовательного определения МОБ молекулярными методами показали, что этот вид анализа обладает значительной прогностической ценностью.

Однако эти исследования проводились в небольших группах больных, что отражает незначительную степень их применимости и делает проточную цитометрию привлекательным инструментом оценки эффекта лечения в течение длительного периода времени.

Показано, что иммунофенотипирование является эффективным методом определения МОБ при миеломе на разных этапах лечения и что полученные этим методом результаты связаны с выживаемостью.

Применение новых препаратов и потенциальное использование еще более новых сделает реальной индивидуализацию лечения на основе точного определения эффекта.

В методических рекомендациях большое внимание уделено релевантности определения МОБ при миеломе; показано также, что проточную цитометрию можно считать методом выбора для такого определения.

Иммунофенотипические методы определения МОБ позволяют проводить сравнение эффективности различных лечебных подходов, подбирать индивидуальные режимы поддерживающей терапии и оценивать их эффективность в режиме непрерывного мониторинга.

Показано, что достижение иммунофенотипической ремиссии обладает прогностической ценностью для таких показателей, как продолжительность жизни без прогрессирования заболевания и общей продолжительности жизни, а также является наиболее релевантным прогностическим фактором у больных, которые являются кандидатами на АТСК.

В этой связи IMWG недавно пересмотрела категорию «строгая полная ремиссия», для которой теперь требуется отсутствие МОБ по данным проточной цитометрии.

Рекомендации по теме

Мероприятия

Мероприятия

Повышаем квалификацию

Посмотреть

Самое выгодное предложение

Самое выгодное предложение

Воспользуйтесь самым выгодным предложением на подписку и станьте читателем уже сейчас

Мы в соцсетях
А еще:
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
Сайт предназначен для медицинских работников!


Материалы для zdrav.ru готовят лучшие эксперты в сфере здравоохранения. Чтобы защитить их авторские права, многие статьи на нашем сайте закрыты

Подтвердите ваш статус медработника - регистрация займет одну минуту.

Пакет готовых инструкций, чтобы пройти проверку Росздравнадзора в подарок!

У меня есть пароль
напомнить
Пароль отправлен на почту
Ввести
Введите эл. почту или логин
Неверный логин или пароль
Неверный пароль
Введите пароль
Я тут впервые
И получить доступ на сайт Займет минуту!
×

Гость, вам предоставлен VIP-доступ к журналу «Справочник заведующего КДЛ»:
возможность скачивать шаблоны • доступ к видеотренингам • книги для КДЛ
Активировать доступ  
Сайт использует файлы cookie. Они позволяют узнавать вас и получать информацию о вашем пользовательском опыте. Это нужно, чтобы улучшать сайт. Посещая страницы сайта и предоставляя свои данные, вы позволяете нам предоставлять их сторонним партнерам. Если согласны, продолжайте пользоваться сайтом. Если нет – установите специальные настройки в браузере или обратитесь в техподдержку.